邓莉，宋丹

（湖北省丹江口市第一医院检验科，湖北丹江口442700）



高胆固醇对小鼠原代成骨细胞Akt/NF-κB信号通路的影响

邓莉，宋丹

（湖北省丹江口市第一医院检验科，湖北丹江口442700）

摘要：目的观察高胆固醇对原代成骨细胞Akt/NF-κB信号通路的影响。方法将小鼠原代成骨细胞按1×105接种于6孔板上，待细胞融合至80%左右，分别加入0μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的胆固醇溶液培养基继续培养24 h。采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）的方法，检测成骨细胞核转录因子kappa B （NF-κB）和蛋白激酶B（Akt）的蛋白表达；采用实时荧光定量PCR方法，检测成骨细胞中人白细胞介素1α （IL-1α）、人白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的信使RNA（mRNA）表达；采用酶联免疫吸附法，检测细胞培养上清中IL-1α、IL-6和TNF-α的蛋白水平。结果胆固醇诱导成骨细胞中NF-κB的增加和Akt磷酸化水平降低，增加IL-1α、IL-6与TNF-α的mRNA和蛋白表达，且呈一定的剂量依赖性。结论高胆固醇可以通过Akt/NF-κB信号通路及其介导的炎症因子表达参与成骨细胞的调节。

关键词：成骨细胞；NF-κB；Akt；胆固醇

胆固醇水平与骨质疏松直接相关［1-3］，高胆固醇血症增加骨吸收、降低骨形成［4］。高胆固醇与原发性骨质疏松有一定关系，如对绝经期、老年性原发骨质疏松患者激素替代治疗可以减少骨质流失，提高骨密度，同时可见胆固醇降低［5-7］。高胆固醇对继发性性骨质疏松也有一定的作用，如糖皮质激素导致的股骨头坏死可见胆固醇升高［8］，胆固醇升高还可作为前列腺癌骨转移的临床指标［9］。胆固醇及其代谢产物可以抑制成骨细胞活性、降低骨盐沉积最终导致骨质疏松［10-11］。他汀类药物可降低血清胆固醇，刺激骨形成、减少骨流失，与骨形态发生蛋白2基因（bone morphogenetic protein 2，BMP2基因）表达增加有关，适当剂量的他汀类药物可用于治疗骨质疏松［12］。成骨细胞对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量平衡和骨损伤修复有着关键作用。因此，在高胆固醇血症导致骨质疏松病理生理过程中，其对成骨细胞的影响起着重要作用。本实验利用原代成骨细胞体外培养观察高胆固醇对Akt/NF-κB信号通路的影响从而探讨高胆固醇诱导骨质疏松发生的作用和可能的分子机制。

1　材料与方法

1.1一般材料

C57BL/6小鼠购自重庆医科大学实验动物中心。DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均购自美国Gibico公司，RNA提取试剂Trizol和荧光试剂SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均购自日本TaKaRa公司，蛋白提取试剂RIPA、PMSF、NaF、Na3VO4和BCA蛋白测定试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司，NF-κB抗体购自美国Abcam公司，蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）及p-Akt抗体均购自美国CST公司，β-actin抗体、HRP标记二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。IL-1α、IL-6和TNF-α酶联免疫试剂盒购自晶美生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠成骨细胞的培养及鉴定取20只出生24 h内的小鼠，引颈处死，75%酒精浸泡10 min。无菌的条件下取出颅盖骨浸泡在D-Hanks液中。分别剪成0.1 mm×0.1 mm×0.1 mm的组织块，加入10 ml 0.25%的胰蛋白溶液，37℃孵育30 min。1 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入0.2%胶原酶10 ml，37℃孵育2 h，每5 min震荡1次。1 000 r/min离心5 min，弃上清。用DMEM培养基冲洗3次。200目滤网过滤去除骨碎片。收获细胞以完全培养基（含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液）重悬，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。放入37℃，5%二氧化碳CO2培养箱培养。每48h换液1次，细胞融合成单层至80%以上时，0.25%胰酶消化制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞纯化。倒置相差显微镜观察细胞形态变化，碱性磷酸酶活性检测鉴定成骨细胞。

1.2.2细胞处理分组实验中细胞主要按照以下分组进行处理，收集第4代细胞进行实验，将原代成骨细胞按1×105接种于6孔板上。将胆固醇溶于乙醇溶液，待细胞生长至80%融合状态时加入不同浓度的胆固醇溶液，胆固醇终浓度为0μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，乙醇浓度为0.25%，对照组为只含有10%FBS的DMEM培养基。

1.2.3实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-PCR）细胞按上述分组进行处理，用不同浓度胆固醇溶液培养基培养24 h，离心管收集培养上清液备用，用预冷的PBS洗涤细胞两次，用Trizol法提取原代成骨细细胞总RNA，逆转录合成cDNA。采用RT-PCR检测目的基因，用2-ΔΔCt值计算目的基因的相对表达量。其中人白细胞介素6 （interleukin 6，IL-6）基因引物正向序列：5'-GAAATC GTGGAAATGAG-3'；反向：5'-TAGGTTTGCCGAGTA GA-3'。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）基因正向引物：5'-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT -3'；反向：5'-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3'。人白细胞介素1α（interleukin 1α，IL-1α）基因引物正向序列：5'-CTCTAGAGCACCATGCTACAG-3'；反向：5'-TTGGAATCCAGGGGAAACACT-3'。内参β-actin基因引物正向序列：5'-GCTGTCCCTGTATG CCTCT-3'；反向：5'-GATGTCACGCACGATTTCC-3'。

1.2.4酶联免疫分析（Elisa）采用酶联免疫试剂盒，按试剂说明进行检测，酶标仪测定450 nm波长处光密度（optical density，OD）值，以标准品浓度和OD值作标准曲线，样品浓度根据标准曲线得出。

1.2.5蛋白质免疫印迹分析（Western blot）提取原代成骨细胞蛋白并用BCA法测定蛋白浓度。取60μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白后转膜到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST 洗3次，HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗3次后加ECL试剂反应，显像、成像。用目的条带与β-actin的灰度值比较表示目的蛋白的相对表达量。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素ANOVA分析，用LSD-t检验或SNK-q检验进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1胆固醇对成骨细胞IL-1α、IL-6和TNF-α mRNA表达的影响

按上述方法分离小鼠原代成骨细胞进行碱性磷酸酶活性检测鉴定，可见大量染色阳性细胞，细胞膜及细胞浆内颗粒染色呈蓝黑色颗粒，鉴定结果见图1。成功分离的成骨细胞接种6孔板，并用不同浓度的胆固醇刺激成骨细胞24 h，实时荧光定量PCR测定IL-1α、IL-6和TNF-α mRNA表达。0μg/ml组与对照组比较各炎症因子的表达基本无变化，说明酒精溶酶基本不影响本实验中炎症因子的表达。不同浓度胆固醇显著诱导IL-1α、IL-6及TNF-α 的mRNA水平，且呈现一定的剂量依赖性，见图2。本结果提示在成骨细胞中胆固醇与炎症因子IL-1α、IL-6和TNF-α的mRNA水平呈正相关。

图1　成骨细胞第2代碱性磷酸酶染色（×400）

图2　不同浓度的胆固醇对成骨细胞IL-1α、IL-6和TNF-α mRNA的影响

2.2胆固醇对成骨细胞IL-1α、IL-6和TNF-α分泌水平的影响

如附表所示，不同浓度的胆固醇刺激成骨细胞24 h后，酶联免疫吸附法测定细胞培养液上清中分泌IL-1α、IL-6和TNF-α的水平变化。0μg/ml组与对照组比较，IL-1α、IL-6及TNF-α均无明显变化；12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml组均能显著诱导IL-1α、IL-6及TNF-α的水平。说明胆固醇可以促进IL-1α、IL-6和TNF-α的分泌，且IL-6的分泌与胆固醇浓度呈正相关。

2.3胆固醇对成骨细胞Akt和NF-κB信号通路的影响

如图3A与3B所示，胆固醇刺激成骨细胞后Western blot测定不同处理组蛋白变化，与对照组比较，12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml 3组中NF-κB水平均显著增加（P＜0.01），而p-Akt水平显著降低（P＜0.01）。提示：成骨细胞中胆固醇浓度与NF-κB蛋白表达一定范围内呈正相关（P＜0.01），胆固醇浓度与成骨细胞Akt磷酸化水平一定范围内呈负相关（P＜0.01），统计结果见图3C与3D。

附表　不同浓度的胆固醇对成骨细胞分泌IL-1α、IL-6 和TNF-α的影响（n=8，pg/ml，±s）

附表　不同浓度的胆固醇对成骨细胞分泌IL-1α、IL-6 和TNF-α的影响（n=8，pg/ml，±s）

注：†与对照组比较，P＜0.01

组别　IL-1α　IL-6　TNF-α对照组　2.21±0.08　 6.28±0.14　 36.05±0.06 0μg/ml组　2.58±0.06　 6.30±0.38　 37.73±0.30 12.5μg/ml组　4.25±0.14†　10.63±1.28†　51.75±3.30†25μg/ml组　3.97±0.17†　16.08±1.05†　52.47±1.48†50μg/ml组　4.36±0.18†　18.77±1.25†　58.69±3.09†

图3　不同浓度胆固醇对成骨细胞Akt和NF-κB信号通路的影响

3　讨论

Akt信号通路及靶基因对骨分化、骨形成和骨重建都有着关键调控作用。血浆网膜素-1 （omentin-1）和胰岛素可以通过增加Akt的磷酸化水平，促进成骨细胞的增殖。敲除Akt1/Akt2的小鼠骨化延迟，敲除Akt2对BMP2没有影响，但可通过对骨特异性转录因子（Runx2）基因的调控阻断骨髓基质细胞或间充质干细胞向成骨细胞的分化［13］。Akt磷酸化可以抑制糖皮激素诱导的成骨细胞凋亡。NF-κB广泛表达于多种组织细胞中，其激活后参与许多基因的转录调控，在免疫、炎症、氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡等生理病理过程中发挥重要调控作用。NF-κB与骨代谢密切相关，γ射线可导致NF-κB活化，促进成骨细胞凋亡。NF-κB p50激活后也可刺激成骨细胞和破骨细胞分泌集落刺激因子1（colony-stimulating factor 1，CSF-1），其在骨的重建中有着重要作用。TNF-α可以刺激成骨细胞NF-κB蛋白与其内源性抑制因子核因子抑制蛋白-κB（nuclean factor-kappa B，IκBα）的解离，短时间可见核周NF-κB蛋白浓度增加，并迅速入核调控目的基因，导致成骨细胞凋亡［14］。NF-κB的抑制剂PMMA可以有效阻断间质细胞向成熟破骨细胞的分化［15］，骨保护素（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG）与NF-κB配体核因子KB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）结合使基质金属蛋白酶9（matix metalloproteinase 9，MMP9）表达增高，阻断破骨细胞的生成、抑制骨的再吸收。本研究结果显示，胆固醇浓度与Akt的磷酸化水平负相关，与NF-κB的表达正相关，提示胆固醇可能通过NF-κB与Akt信号通路介导成骨细胞分化过程。

PI3K/Akt是调节NF-κB及下游基因表达的重要信号通路。过表达的胰岛素受体底物1（insulin receptor 1，IRS1）可通过PI3K/Akt信号通路抑制NF-κB和其下游BAX基因（Bcl2-associated X protein，BAX）的表达促进成骨细胞增殖，且上述作用可以被PI3K的抑制剂LY294002所逆转［16］。PI3K/Akt磷酸化后，激活NF-κB及其调控下游细胞因子和炎症介质TNF-α、IL-1α及IL-6的释放［17］。TNF-α、IL-1α、IL-6等炎症介质的分泌可以促进炎症反应，不仅对破骨细胞性骨吸收有明显促进作用，而且还能影响成骨细胞性骨形成。TNF-α能够抑制胶原合成、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性和骨钙素合成，同时可以通过NF-κB途径增加IL-6、IL-1α和ICAM1基因的表达从而增加骨质流失。IL-6在骨更新中有着重要作用，成骨细胞分泌的IL-6与多种细胞因子共同作用促进骨吸收和骨重建［18，19］。本研究观察结果显示，高胆固醇促进TNF-α、IL-1α与IL-6表达，而且表达水平与胆固醇浓度正相关，提示高胆固醇可能通过Akt/NF-κB信号通路促进炎症反应，从而影响成骨细胞分化过程。

综上所述，高胆固醇可能通过抑制Akt活性激活NF-κB信号通路，进一步诱导炎症因子的释放，从而影响成骨细胞分化，最终导致成骨细胞与破骨细胞的动态失衡而增加骨质疏松发病风险。

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（张蕾编辑）

论著

Effects of high-level cholesterol on Akt/NF-κB signaling pathway of mouse primary osteoblasts

Li Deng，Dan Song
（Department of Laboratory，Danjiangkou First Hospital，Danjiangkou，Hubei 442700，China）

Abstract：Objective To observe the effects of high-level cholesterol on Akt/NF-κB signaling pathway of primary osteoblasts. Methods Mouse primary osteoblasts were seeded at 1×105to 6-well plates. At 80%fusion，the cells were stimulated with 0 μg/ml，12.5 μg/ml，25 μg/ml and 50 μg/ml cholesterol solution culture medium respectively for 24 hours. The protein levels of NF-κB and phosphorylation of Akt were detected by Western blot. The levels of IL-1α，IL-6 and TNF-α were detected by RT-qPCR and ELISA. Results High-level cholesterol increased the NF-κB protein level and decreased phosphorylation of Akt. High-level cholesterol increased not only the mRNA levels but also protein levels of IL-1α，IL-6 and TNF-α. Conclusions Together，these results have uncovered a role of cholesterol in osteoblasts and provided the evidence that treatment with cholesterol at a high dosage may influence the levels of inflammatory factors through Akt/NF-κB signaling pathway in osteoblasts.

Keywords：osteoblast；NF-κB；AKT；cholesterol

中图分类号：R589.9；R-332

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.002

文章编号：1005-8982（2016）10-0006-05

收稿日期：2015-10-26