王自文，董 辉，赵其平，夏伟丽,2，朱顺海，门启婓,2，李 聪，朱雪龙，韩红玉，黄 兵,3

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241；2. 上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）



柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4酵母双杂交诱饵质粒的构建与检测

王自文1，董 辉1，赵其平1，夏伟丽1,2，朱顺海1，门启婓1,2，李 聪1，朱雪龙1，韩红玉1，黄 兵1,3

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241；2. 上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

摘 要：为了筛选出柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶（EtCDPK4）在虫体内发挥作用时的作用受体即相互作用蛋白，构建了能够应用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK4，本研究以柔嫩艾美耳球虫子孢子为材料，提取了总RNA，经反转录得到cDNA第一链，利用PCR的方法扩增获得了该基因大小为1660 bp的EtCDPK4的功能区片段，并将其连接于酵母BD诱饵pGBKT7载体上，经双酶切鉴定和序列分析，以及检测了pGBKT7-EtCDPK4在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性和表达情况。结果显示，成功构建了酵母双杂交诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK4，在酵母双杂交系统中没有自激活活性和细胞毒性，且在酵母细胞Y2HGold中能够进行表达。表明所构建的诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4可以应用于酵母双杂交系统中，用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，获得可能与EtCDPK4具有相互作用的蛋白质。……