屈海峰，白殿国，于占春，岳 军，王继艳，宁艳春，李爱力，徐友海，胡世洋

(1.中国石油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132021；2.吉林燃料乙醇有限责任公司，吉林 吉林 132101；3.钦州出入境检验检疫局，广西 钦州 535000)

化石燃料燃烧所排放的大量二氧化碳，造成了严重的温室效应，同时机动车尾气也是引起雾霾的原因之一。我国是一个农业大国，每年的农作物秸秆量约达7亿t，除少部分被利用外，大部分被焚烧，造成了严重的环境污染。而将秸秆转化为燃料乙醇，替代部分汽油使用，可以减少二氧化碳的排放，同时也可解决因秸秆焚烧所造成的环境问题[1-2]。

将木质纤维素材料转化为乙醇，首先需要将大分子状态的纤维素转化为酵母可以利用的可发酵性糖。主要途径有两条：一是通过酸法水解木质纤维素材料为可发酵性糖，另一条途径是生物转化法。由于酸法存在一系列的问题，生物转化法已成为主要的发展方向[3-4]。

里氏木霉是常用于发酵生产纤维素酶的菌株，能够分泌较多的胞外蛋白，酶系构成中外切酶组分占到蛋白含量的60%～70%，且比较均衡[5-6]。但是受制于较低的酶活性，如何提高里氏木霉的产酶能力仍是研究的重点。一方面可对菌株进行遗传改造[7-8]，另一方面可通过发酵控制策略的研究，优化发酵条件，充分发挥菌株的性能[9-10]。碳源、氮源是影响里氏木霉产纤维素酶的两个主要因素，很多文献研究了碳、氮源种类对于酶活的影响，但多使用昂贵的纤维素粉、乳糖、酵母粉、玉米浆、豆饼粉，这些物质的使用增加了纤维素酶的生产成本[11-12]，因此有必要研究使用廉价的碳、氮源替代，从而降低成本。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

菌种为里氏木霉B4菌株：由本实验室保存，保存条件为4 ℃，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)，保存过程中每月将菌株进行重复培养。

葡萄糖、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、NaNO3，MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O：均为分析纯，玉米芯粉、麦麸：市售。

电热恒温水浴锅：HHS，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；振荡培养箱：BS-1E，金坛市富华仪器有限公司；离心机：Anke TGL-16G，上海安亭科学仪器厂；微孔板光谱仪：Spectra Max Plus 384，美国 Molecular Device；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。

种子培养基(1 L)：20 g葡萄糖、3 g KH2PO4、5 g(NH4)2SO4、0.5 g MgSO4、3 g CaCO3、2 g NaNO3，上述物质加水配制成1 L溶液，pH值自然，500 mL的三角瓶中装入100 mL培养基，以上培养基均匀配制分装后121 ℃灭菌30 min。

产酶培养基(1 L)：培养基中含有不同含量的玉米芯粉、麦麸、(NH4)2SO4，其余与种子培养基相同，500 mL的三角瓶中装入100 mL培养基，以上培养基均匀配制分装后121 ℃灭菌30 min。

微量元素浓缩液(1 L)：250 mg MnSO4·H2O、360 mg ZnSO4·7H2O、370 mg CoCl2·6H2O、750 mg FeSO4·7H2O，上述物质加水配制成1 L溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 种子制备

加入孢子悬液1 mL(孢子数量控制在106～108/mL)到灭菌后的种子培养基中，接种后置于恒温振荡培养箱中28 ℃，180 r/min下培养40 h，作为一级种子备用。

1.2.2 产酶培养

吸取10 mL种子液在无菌操作条件下，加入到产酶培养基中，放入恒温振荡培养箱中于28 ℃，180 r/min下培养96 h，培养过程中，每24 h取样并测定滤纸酶活。

1.2.3 实验设计

采用Minitab 15进行中心组合设计及统计学分析，利用Statistica 6.0软件进行响应面的分析。

1.2.4 滤纸酶活测定

滤纸酶活(FPase)的测定：将Waterman 1号滤纸裁剪成1 cm×6 cm大小的长条形状，质量为49.5～50.5 mg，折叠成M状放入25 mL比色管底部，加入 pH=4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液1 mL，然后加入0.5 mL稀释适当倍数的粗酶液并混匀，对照为煮沸10 min灭活的相同稀释倍数的粗酶液。于50 ℃水浴水解60 min，然后用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖(以葡萄糖计)。FPase酶活力的定义是以上述条件下每分钟水解底物产生1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(IU)。

2 结果与讨论

2.1 三因素中心组合优化

碳源、氮源是影响里氏木霉产纤维素酶的主要因素[13-14]，其中硫酸铵与豆饼粉是纤维素酶发酵过程中常用的两种氮源，两种氮源中硫酸铵为生理酸性盐，而豆饼粉被利用后，发酵液pH值呈碱性，里氏木霉的最适生长pH值在4～5，pH值过高会造成菌丝生长裂解，产酶量下降。相关研究表明在里氏木霉产纤维素酶的过程中，相比于有机氮源[15]，无机氮源硫酸铵已经足够菌丝的生长及酶的分泌，并且采用廉价易得的麦麸及玉米芯代替价格较高的纤维素粉为碳源，可以降低成本。

实验过程中以麦麸、玉米芯、硫酸铵为主要因素，以滤纸酶活为响应值进行了三因素五水平的优化，并使用Statistic 6.0与Minitab 15软件进行响应面及统计学分析，因子及水平设计见表1，实验结果及预测结果对比见表2。

表1 三因素中心组合水平表

表2 中心组合因子水平设计及实验结果预测结果对比表

续表

响应面法可以直观看出因素对于响应值的影响，并且可以得出进一步的优化方向或是最佳工艺条件，为了对里氏木霉产纤维素酶的条件进行优化，利用Statistic 6.0软件分析了中心组合三个因素：ρ(麦麸)、ρ(玉米芯)和ρ(硫酸铵)对响应值滤纸酶活的影响，结果见图1～图3。通过对响应曲面和等高线图的分析可以看出ρ(麦麸)、ρ(玉米芯)和ρ(硫酸铵)这三个因素对于滤纸酶活的影响趋势。

图1 中心组合响应面图(硫酸铵与玉米芯交互作用)

图2 中心组合响应面图(麦麸与玉米芯交互作用)

图3 中心组合响应面图(麦麸与硫酸铵交互作用)

由图1可知，当ρ(硫酸铵)由低水平增加到高水平时酶活有增加的趋势，固定硫酸铵用量，ρ(玉米芯)无论在低水平与高水平时都不利于产酶，较高的产酶区间是ρ(玉米芯)=40～60 g/L。

由图2可知，ρ(玉米芯)在高水平和低水平时，酶活都处在较低值，从三维曲面图中可以得出，当ρ(玉米芯)=50 g/L时，响应曲面的颜色最深，表示酶活处于最高值，因此为取得较高的酶产量，ρ(玉米芯)=50 g/L为宜；固定ρ(玉米芯)，ρ(麦麸)由低水平增加到高水平时酶活逐渐降低，因此为提高酶的产量应减少麦麸的用量。

由图3可知，当ρ(麦麸)处于高水平而ρ(硫酸铵)处于低水平时酶活处于较高值，ρ(麦麸)处于高水平增加硫酸铵的用量会降低滤纸酶活；ρ(麦麸)与ρ(硫酸铵)同时处于低水平时酶活也处于较低值；当ρ(麦麸)处于低水平而ρ(硫酸铵)处于高水平时，酶活趋于增加的趋势。因此为增加滤纸酶活应增加硫酸铵的用量而相应的降低麦麸的用量。ρ(玉米芯)、ρ(硫酸铵)和ρ(麦麸)三个因素中，ρ(麦麸)对产酶的影响最小，应降低麦麸的用量。

利用Minitab软件对于ρ(玉米芯)、ρ(硫酸铵)和ρ(麦麸)三因素中心组合实验结果进行了统计学分析，结果见表3。

表3 中心组合优化以滤纸酶活为响应值的结果分析

表4 以滤纸酶活为响应值的拟合模型统计学分析

2.2 两因素中心组合优化

在三因素的中心组合优化实验中，发现麦麸的加入量在低水平时对产酶更加有利，因此培养基中不添加麦麸，只对ρ(玉米芯)与ρ(硫酸铵)进行两因素五水平的全因子优化，利用Minitab软件进行实验设计，各水平实验值见表5。实验结果与模型的预测值见表6。

表5 二因素中心组合水平表

表6 二因素全因子水平设计及实验结果预测结果对比表

利用Statistic 6.0软件对ρ(玉米芯)、ρ(硫酸铵)以及滤纸酶活为响应值时进行了响应面分析(见图4)。通过对响应曲面和等高线图的分析可以看出，当ρ(玉米芯)<55 g/L时，无论硫酸铵在低水平与高水平时酶活都处于较低值，只有ρ(玉米芯)>55 g/L时，滤纸酶活才逐渐增加。较适宜的ρ(硫酸铵)=12 g/L，继续增加硫酸铵的用量导致酶活下降。

图4 二因素全因子响应面(玉米芯与硫酸铵交互作用)

表7 中心组合优化以滤纸酶活为响应值的结果分析

表8 以滤纸酶活为响应值的拟合模型统计学分析

3 结 论

采用廉价易得的碳源玉米芯、氮源硫酸铵，经过三因素五水平及两因素五水平两轮实验，里氏木霉产酶培养条件得到了优化。仅采用硫酸铵做为氮源也可以满足菌体的生长与产酶需求，模型预测的最优组成为ρ(玉米芯)=75 g/L、ρ(硫酸铵)=12 g/L，此条件下滤纸酶活为3.12 FPU/mL,较优化前提高58.38%，回归模型的p<0.05，模型显著，可以用于对实验结果的预测。

参 考 文 献：

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