王大威, 张健, 马挺, 吕鑫, 何春百

1. 海洋石油高效开发国家重点实验室, 北京 100028

2. 中海油研究总院, 北京 100028

3. 南开大学生命科学学院分子微生物学与技术教育部重点实验室, 天津 300071

用PCR-DGGE方法分析渤海原油降解过程微生物群落结构变化

王大威1,2*, 张健1,2, 马挺3, 吕鑫1,2, 何春百1,2

1. 海洋石油高效开发国家重点实验室, 北京 100028

2. 中海油研究总院, 北京 100028

3. 南开大学生命科学学院分子微生物学与技术教育部重点实验室, 天津 300071

针对渤海油田原油粘度大、含水上升快、常规措施作用不明显的特点, 采用微生物采油技术开展提高稠油采收率研究。通过室内物理模拟实验, 结合变性梯度凝胶电泳(Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 技术及原油粘度测定分析研究均质、非均质岩心驱替前后稠油采收率变化、微生物群落丰度结构变化、原油理化性质变化, 尝试分析微生物提高稠油采收率机理。物模结果表明： 微生物采油体系能够有效提高稠油采收率, 在均质岩心和非均质岩心驱替中, 微生物体系可分别提高采收率14.4%、29.4%; DGGE结果显示： 微生物体系出口端丰度明显高于注入端;原油粘度测定显示： 出口端原油粘度明显下降。三者结合说明微生物体系能够利用稠油作为碳源, 在地层环境中生长,菌种在地层中有较强的适应性, 同时能够降低稠油粘度, 提高其采收率。

稠油; 微生物采油; DGGE; 降粘; 机理

1 前言

微生物采油技术(Microbial Enhanced Oil Recovery, MEOR)发展至今已有90多年的历史, 目前MEOR技术已经成功地应用于单井吞吐、调剖、降粘等方面,该技术能够经济有效地延长油田开采周期, 提高近枯竭油藏的采收率[1]。但目前该技术的应用受到一定的限制, 主要原因在于微生物采油技术机理较为复杂, 同时油藏作为“黑箱”体系, 科研人员用传统培养方法所获得的微生物生态信息远不能反映油藏环境中的实际情况, 无法有效获知微生物在地层中运移、群落丰度变化、菌种种群变化等参数, 不能合理对现场试验结果进行解释分析, 无法确定提高采收率的主要机理, 因此影响微生物采油技术深入发展的主要难点是缺乏有效的采油微生物群落结构变化与采收率关系分析及动态变化的监测方法[2-5]。

近年来基因组学和现代分子技术的成熟, 逐渐渗透到有关生命科学的整个领域, 也为微生物生态学提供了新的研究方法和机遇。自1985年Pace等以核酸测序技术研究微生物的生态和进化问题以来,对微生物的多样性研究进入了一个新的阶段, 并逐步发展形成了成型的微生物分子生态学(Molecular Ecological Technology of Microorganisms)方法和技术。变性梯度凝胶电泳(Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术,是一种通过分离微生物基因组DNA 来研究环境样品中微生物群落的多样性及物种丰度的一种分子指纹技术[6-8], 1993年Muzyers等首次将DGGE技术应用于分子微生物学研究领域, 并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。近年来运用分子指纹技术对油藏微生物群落的研究已有不少[9-15], 但少有文献报道在微生物物理模拟驱油实验过程中研究采油微生物群落结构变化与采收率动态关系[16-18]。

本文尝试通过室内物理模拟实验, 结合变性梯度凝胶电泳(Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 技术及原油粘度测定研究均质、非均质岩心驱替前后稠油采收率、含水、压力变化、微生物群落丰度结构变化、原油理化性质变化, 以分析微生物提高稠油采收率机理, 为今后微生物采油现场应用效果解释提供依据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 地层水、原油样品： NB35-2 A18井原油, 粘度523.3 mPa·s, 沥青7.79%, 胶质20.25%; NB35-2 A18井地层水。

2.1.2 发酵培养基 (g·L-1)： Na2HPO40.6, KH2PO40.2, NaNO32, FeSO40.02, MgSO40.3, 酵母粉 0.5,蔗糖 1, pH 7.2。

2.1.3 菌种： 产表面活性剂菌 T-1(Pseudomonas aeruginosa, 铜绿假单胞菌属)、X-3(Bacillus Subtilis,枯草芽孢杆菌), 由实验室分离保存; 稠油降解菌：QB26(Bacillus licheniformis, 地衣芽孢杆菌)、QB36 (Geobacillus pallidus, 白色地芽孢杆菌), 由实验室从NB35-2油田地层油水样分离保存。

2.1.4 微生物调剖剂： 黄原胶 0.2%、氯化铬 0.1 M·L-1、醋酸1ml/L, 搅拌混合。

2.1.5 岩心

(1) 均质岩心参数

(2) 非均质岩心参数

2.2 方法

2.2.1 菌种对原油的降粘作用

表1 均质岩心参数Tab. 1 Homogeneous core parameters

利用BROOK FIELD VISCOMETER LVDV-II+Pro提桶式粘度计测定原油和菌种对原油作用后的粘度变化。

表2 非均质岩心参数Tab. 2 Heterogeneous core parameters

2.2.2 菌种的富集培养

将T-1、X-3、QB26、QB36 4菌种在发酵培养基中富集培养后, 按一定比例复配成微生物稠油降粘体系, 体系粘度22.3mPa·s, 备用。

2.2.3 基因组DNA的提取与纯化

原始水样中菌体用孔径为0.22 μm的混合纤维素酯滤膜抽滤1L水样来收集, 经培养后的菌体直接取10mL培养液高速离心机上6000 r·min-1速度离心10—15 min获得。具体操作步骤与文献[14]相同。基因组DNA提取与纯化使用北京天为时代生物技术公司的DNA 纯化试剂盒, 按照操作说明进行。

2.2.4 16S rDNA 的PCR扩增

采用可得到更多微生物多样性信息的 V9区引物进行细菌16S rDNA PCR扩增, 因要进行DGGE分析, 故此处的引物带GC夹子, 细菌V9区： 1406r-GC： 5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCCC ACG GGC GGT GTG TAC-3’; 1055f： 5′-ATG GCT GTC GTC AGC T-3′。

琼脂糖凝胶电泳检测： 条带在400～500bp左右。

2.2.5 16S rDNA 序列DGGE分析

将纯化好的PCR 样品加入制备好的变性胶中,进行电泳分离，并用YLN22000凝胶影像分析系统分析, 观察每个样品的电泳图谱并拍照。

2.2.6 微生物驱油体系在岩心研究的增油效果

均质岩心实验： 研究不同油藏空隙体积下(PV数)微生物段塞在均质岩心的提高采收率效果。水驱含水 70%后, 倒换阀门, 分别注入微生物段塞(菌液+营养液)0.3、0.6 PV。注入完成关闭岩心夹持器两端阀门, 闷井 5 d, 同时做空白对照, 直接水驱至含水95%。

非均质岩心实验： 研究在非均质岩心实验中加入调剖段塞对微生物采油体系的影响。当水驱油出液量达到0.1 PV时, 水驱含水70%后, 立即倒换阀门转注0.2 PV调剖段塞(黄胞胶+镉离子交联)。当出液量达到0.2 PV时, 立即倒换阀门转注0.1 PV微生物段塞(营养液+菌液)防止成胶过后岩心注入端堵塞, 出液量达到0.1 PV时, 立即关闭岩心夹持器两端阀门约3 h等待成胶。成胶后继续注入0.5 PV混合溶液(营养液+菌液)。注入完成关闭岩心夹持器两端阀门, 焖井5 d, 水驱至含水95%。同时做空白对照, 只加入微生物段塞 0.6 PV, 注入完成关闭岩心夹持器两端阀门, 焖井5 d, 水驱至含水95%。

3 结果与讨论

3.1 微生物驱油体系在均质岩心中的增油效果

微生物驱油体系在均质岩心中的增油效果见图1, 同时研究了不同大小的微生物段塞对采收率的影响。

从图 1可以看出, 微生物段塞大小对最终采收率影响较大。0.3 PV的微生物段塞最终采收率为40.6%, 比水驱提高3.8%; 将微生物段塞倍增后, 0.6 PV的微生物段塞的最终采收率为51.2%, 比水驱提高 14.4%, 说明当微生物段塞的大小超过一定水平,微生物在岩心中分布的范围更大, 可处理更多稠油,降低稠油粘度, 降低油水流度比, 后续水驱能更大程度的启动剩余油, 对采收率具有较大的影响。

图1 均质岩心模型驱替实验数据Fig. 1 Result of homogeneous cores physical model simulations

图2 均质岩心驱替后截面图Fig. 2 Sectional view of homogeneous core flooding

对比驱替后的岩心截面可看到, 空白实验的岩心内部尚残留大量原油未被驱出, 而注入0.3 PV和0.6 PV微生物段塞的岩心被驱替的比较充分, 说明微生物注入到均质岩心中, 通过降解稠油和产生乳化剂, 降低了油水流度比, 提高了稠油采收率。

3.2 微生物驱油体系在非均质岩心的增油效果研究

微生物驱油体系在非均质岩心中的驱油效果见图 3, 研究在非均质岩心中加入生物聚合物前置段塞对采收率的影响。

从图 3可以看出, 生物聚合物段塞的加入对采收率作用明显, 不加聚合物段塞的最终采收率为40.8%, 比水驱提高 22.4%, 加入段塞的最终采收率为47.9%, 比水驱提高29.4%, 聚合物段塞的加入有效调节吸水剖面, 封堵高渗条带, 一方面能够使注入体系进入中低渗层位, 提高波及效率, 另一方面采油微生物进入中低渗透层后利用其中存在的剩余油, 降低稠油粘度, 提高了驱油效率, 这两方面均是提高采收率的基本机理, 因而聚合物段塞的加入能明显提高稠油采收率。

由图 4所示, 非均质岩心在驱替完成后出现大片淡黄色斑纹, 说明微生物在油藏环境下能够很好的降解原油, 产生表面活性剂, 同时启动了中低渗层的稠油, 为后续水驱提供了良好的条件, 进一步提高采收率。

图3 非均质岩心模型驱替实验数据Fig. 3 Result of heterogonous cores physical model simulations

图4 非均质岩心驱替后截面图(非均质岩心体系2)Fig. 4 Sectional view of heterogeneous core flooding (heterogeneous core system 2)

3.3 驱替实验前后样品的DGGE条带分析

将T-1、X-3、QB26、QB36四株菌种培养物、注入体系(空白 1)、产出液、地层水(空白 2)分别提取DNA, 通过DGGE对不同体系中菌种浓度进行分析, 结果见图5。从图中可以看到, QB26作为对稠油降粘起作用的优势菌种, 产出液中的含量高于注入体系, 同时也高于其他采油菌种, 说明QB26在岩心中可利用稠油作为碳源进行生长, 因其利用稠油和营养的能力更强, 在菌群分布中处于统治地位; QB36同样作为稠油降解菌, 产出端菌浓也高于注入端, 但明显低于QB26产出端菌浓, 可能是由于其在地层中利用稠油和注入营养液的能力与QB26相比低下, 因此造成其生长速度低于 QB26, 说明QB26在稠油降粘中起主导作用; T-1、X-3菌种产出端条带亮度低于注入端, 说明产出端菌浓比注入端低, 原因在于T-1、X-3菌种为产表面活性剂菌种,主要为专性好氧菌, 由于地层深部氧气含量低, 专性好氧菌在与QB26、QB36等兼性好氧稠油降解菌的竞争中处于下风, 其菌种浓度呈下降趋势, 主要作用物-表面活性剂(乳化剂)的产生是在发酵罐中进行的, 地层中相应也会产生表面活性剂(乳化剂), 但含量较低。

从不同岩心实验结果看, 均质岩心实验中, 均质岩心体系2(0.6 PV)对比均质岩心体系1(0.3 PV),优势菌 QB26菌浓前者明显高于后者, 且菌种种类也有所增加, 这说明增大注入体积可提高菌液在岩心中的分布, 促进菌种利用更多剩余油, 结果是一方面增加了菌液浓度, 一方面提高了稠油采收率。

非均质岩心实验中, 非均质岩心产出端优势菌QB26菌浓均高于均质岩心, 同时非均质岩心产出端菌种种类多于均质岩心, 分析原因在于： 均质岩心水驱程度较高, 岩心内剩余油含量低, 微生物驱油体系可利用的稠油较少, 而非均质岩心由于存在渗透率级差, 水驱主要动用高渗层位稠油, 而中低渗层位稠油大部分未被启动, 可作为稠油降解菌的碳源, 故非均质岩心中QB26菌浓高于均质岩心。从非均质岩心实验中不同段塞结果来看, 加入聚合物段塞的岩心实验产出端QB26菌浓高于未加入聚合物段塞的岩心。分析原因在于： 尽管注入体系本身具有一定粘度, 但未加入聚合物段塞无法有效调整岩心吸水剖面, 造成注入体系只进入高渗层位, 但高渗层位中的稠油水驱后剩余油含量较低, 同时采油菌因进入中低渗层位较少, 因此无法有效启动剩余油; 加入聚合物段塞后, 有效控制了吸水剖面,注入体系能够进入中低渗层位, 并启动这些部位的剩余油, 微生物可以稠油为碳源生长, 因此其菌浓高于未加入聚合物段塞的岩心实验结果。

图5 16S rDNA 扩增产物的DGGE电泳图Fig. 5 DGGE profile of 16S rDNA amplified products

3.4 驱替实验前后稠油界面张力、粘度测定

3.4.1 驱替实验前后界面张力变化

驱替实验结束后, 将微生物驱油体系作用后的原油乳状液破乳, 得到脱油水, 其界面张力见表3。从表可以看到, 与地层水样和注入体系相比, 产出端样品的界面张力分别下降 71.7%和 31.4%, 同时pH值也有所降低, 分别由地层水样的7.2和注入体系的7.0降低到6.2, 这说明菌株在岩心内能够繁殖,同时代谢过程中产生了表面活性物质和有机酸等物质, 结合 DGGE结果, 进一步说明稠油降解菌在表面活性剂的协助下, 利用加入的营养剂作用于稠油,产生表面活性物质和有机酸等降粘物质。

3.4.2 驱替实验前后稠油粘度变化

表3 微生物作用前后界面张力及pH值变化Tab. 3 Interfacial tension and pH changes after microorganisms degradation

表4 微生物作用前后粘度变化Tab. 4 Viscosity changesafter microorganisms degradation

表4 微生物作用前后粘度变化Tab. 4 Viscosity changesafter microorganisms degradation

样品号 粘度/(mPa·s) 降粘率/%模拟油(空白) 210.6 -非均质岩心2产出端乳状液 47.5 77.4非均质岩心2产出端脱水油 155.1 26.4

驱替实验结束后, 测定产出油水乳状液粘度,然后对乳状液进行破乳, 得到脱水油, 测定其粘度见表 4。由表 4可知, 模拟油在 55 ℃下的粘度为210.6 mPa·s, 产出乳状液粘度为47.5 mPa·s, 经过微生物体系作用后的脱水油粘度为155.1 mPa·s。说明微生物作用稠油主要机理有二： 一为产生表面活性物质, 乳化稠油; 二为降解稠油中的胶质、沥青质等烃重质组分, 改变原油品质, 降低原油粘度, 使其在后续水驱过程中更易流动, 这其中稠油乳化是主要机理, 同时稠油中重组分降解因其不可逆性也十分重要。

实验最初拟将驱替实验产出端原油进行四组分分析, 以进一步研究稠油降解菌对稠油的降解作用,但由于饱和用油为模拟油(柴油和稠油的混合体系),无法反应油藏的实际情况。

4 结论

本实验结合 DGGE、原油粘度测定, 针对均质岩心、非均质岩心物理模拟驱油实验中, 采油微生物对原油粘度和采收率的影响及其作用机理进行了研究, 结果显示： 一方面, 微生物注入岩心后, 稠油粘度降低, 采收率明显提高, 同时菌株浓度也相应升高, 说明采油微生物能够利用岩心内稠油作为碳源生长, 其降解稠油和产生生物乳化剂作用对改善原油粘度和提高采收率具有显著效果, 该驱油体系在稠油开发中具有一定的应用前景; 另一方面说明DGGE技术作为一种微生物生态结构、丰度的检测手段, 具有快速、灵敏的特点, 结合现场实际条件,其应用对今后微生物采油中培养基优化、菌种筛选、配伍性研究、现场跟踪监测具有重要指导意义。

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Analysis of bacterial communities in Bohai heavy oil degradation by 16S rDNA-PCR-DGGE

WANG Dawei1,2*, ZHANG Jian1,2, MA Ting3, LV Xin1,2, HE Chunbai1,2

1. State Key Laboratory of Offshore Oil Exploitation, Beijing 100028, China
2. China National Offshore Oil Corporation (CNOOC) Research Institute, Beijing 100028, China
3. Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology, Ministry of Education, College of Life Science, Nankai University, Tianjin 300071, China

Due to the reasons such as high viscosity of crude oil, quick increase of water, decrease of oil production, microbial enhanced oil recovery (MEOR) technology was used for improving heavy oil recovery in Bohai oil field. In this study, the recovery, moisture, pressure changes of homogeneous, non-homogeneous core flooding were studied by physical simulation experiments; structural and abundance changes of microbial communities were studied by denaturing gradient gel electrophoresis (Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) technology; physical and chemical properties changes of crude oil were studied by oil viscosity measurement, and the mechanism of microbial enhanced heavy oil recovery was analyzed. Flooding simulation results showed that MEOR system could effectively enhance oil recovery, which could enhance oil recovery by 14.4% and 29.4%, respectively in homogeneous and non-homogeneous core flooding experiments; DGGE results showed that microbial system abundance of the outletend was significantly higher than that of injection end; crude oil viscosity measurement results showed that oil viscosity of the outlet end decreased. The results suggested that microorganisms could use heavy oil as carbon source, grow in the formation environment, reduce the viscosity of heavy oil and improve recovery, so that this technology has broad application prospects in Bohai heavy oil development .

heavy oil; microbial enhanced oil recovery; denature gradient gel electrophoresis; viscosity reduction; mechanism

10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.01.019

TE122.14

A

1008-8873(2016)01-124-06

2015-01-23;

2015-11-03

十一五国家科技重大专项“海上油田化学驱油技术”(2011ZX05024-004)

王大威(1978—), 男, 2009年毕业于东北石油大学油气田开发专业, 现任中海油研究总院采油工程师, 研究方向： 微生物采油等三次采油技术研究, E-mail： wangdw3@cnooc.com.cn

*通信作者：王大威, E-mail： wangdw3@cnooc.com.cn王大威, 张健, 马挺, 等. 用PCR-DGGE方法分析渤海原油降解过程微生物群落结构变化[J]. 生态科学, 2016, 35(1)： 124-129. WANG Dawei, ZHANG Jian, MA Ting, et al. Analysis of bacterial communities in Bohai heavy oil degradation by 16S

rDNA-PCR-DGGE[J]. Ecological Science, 2016, 35(1)： 124-129.