崔　凯，　李　瑞，　王　涛，　叶章群，　刘继红△，　饶　可△

华中科技大学同济医学院附属同济医院　1泌尿外科　2泌尿外科研究所，武汉　430030



雄激素调控RhoA/Rho激酶改善去势大鼠勃起功能障碍的机制研究*

崔凯1，2，李瑞1，2，王涛1，2，叶章群1，2，刘继红1，2△，饶可1，2△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1泌尿外科2泌尿外科研究所，武汉430030

摘要：目的探究雄激素调控RhoA/Rho激酶改善去势大鼠勃起功能障碍的机制。方法40只健康8周龄SD雄性大鼠随机分成4组：A组为对照组；B组为实验组，给予手术切除双侧睾丸；C、D组为干预组，大鼠手术去势后每天给予不同浓度的十一酸睾酮(安特尔)灌胃(C组：20 mg/kg，D组：10 mg/kg)，其余组给予等量的生理盐水。治疗8周后，检测大鼠血清睾酮浓度，海绵体测压评价大鼠勃起功能，Western blot检测大鼠阴茎海绵体S1P2/RhoA/Rho激酶的含量。结果相较于A组[(17.08±1.53)nmol/L]、C组[(15.47±1.62)nmol/L]和D组[(8.73±2.12)nmol/L]大鼠的血清睾酮浓度，B组[(1.34±0.62)nmol/L]明显降低(均P<0.05)；海绵体测压结果显示B组MaxICP/MAP明显小于A组、C组和D组(均P<0.05)；Western blot检测S1P2、RhoA、ROCK1和ROCK2的蛋白在B组表达明显高于A组、C组和D组(均P<0.05)。结论应用安特尔进行雄激素替代治疗可以通过抑制S1P2/RhoA/Rho激酶的激活，从而抑制阴茎海绵体平滑肌收缩，改善去势大鼠勃起功能。

关键词：RhoA/Rho激酶；雄激素；去势；勃起功能障碍

阴茎勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是指阴茎不能达到和(或)维持足够的勃起硬度以获得满意的性生活[1]。来自马萨诸塞州的一份报告显示：全球年龄在40～70岁之间的男子中，ED的患病率高达52%[2]。如今，ED正在成为困扰全球男性的重要疾病之一。ED的发病因素有很多种，包括神经因素、血管因素、内分泌因素以及同样重要的心理因素，其中由于老龄等因素引起的血清睾酮水平下降是导致ED的重要危险因素之一[3]。近年来受到广泛关注的迟发型性腺功能减退症(late-onset hypogonadism，LOH)就是一种与年龄增长相关的并且以血清睾酮低于正常水平为特征的临床和生物化学综合征，而由于血清睾酮水平降低而导致的ED则是LOH最主要的症状[4-5]。正常的血清睾酮水平是维持阴茎正常勃起的关键因素[6]。

阴茎勃起受到一氧化氮-环鸟苷酸(nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate，NO-cGMP)，RhoA/Rho激酶，硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)等多种信号通路共同调节。已有的研究认为血清睾酮水平下降能够通过NO-cGMP通路减少内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性和引起阴茎血管内皮细胞功能障碍导致ED[7],而对于睾酮和RhoA/Rho激酶途径之间的联系研究较少。最近研究发现，主要由血小板和红细胞产生的一种1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)的鞘氨醇代谢产物可以通过作用于阴茎海绵体平滑肌上的S1P2受体，进而激活RhoA/Rho激酶途径，引起阴茎海绵体平滑肌收缩[8]。本实验对大鼠手术去势之后给予不同浓度十一酸睾酮胺丸(安特尔)灌胃[9]，然后通过评价大鼠的勃起功能和检测阴茎组织蛋白表达的结果，研究补充睾酮改善去势大鼠勃起功能和S1P2以及RhoA/Rho激酶之间的联系。

1材料与方法

1.1实验材料

40只健康8周龄SD雄性大鼠(由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供)；十一酸睾酮胶丸(安特尔，默沙东公司提供)；睾酮测定试剂盒(直接化学发光法，Siemens Healthcare Diagnostics Inc，美国)；RIPA裂解液(江苏碧云天生物公司)；S1P2抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；RhoA抗体(英国Abcam公司)；ROCK1抗体(英国Abcam公司)；ROCK2抗体(美国Santa Cruz公司)；羊抗兔和羊抗鼠二抗(武汉科瑞生物科技有限公司)；Powerlab四通道生理记录仪(澳大利亚AD Instruments公司)。

1.2模型的建立

40只健康8周龄SD雄性大鼠，体重250～310 g，适应性喂养1周后随机分成4组：A组为对照组；B组为实验组，给予手术切除双侧睾丸；C、D组为干预组，在大鼠手术去势后每天给予不同浓度的安特尔灌胃(C组：20 mg/kg，D组：10 mg/kg)，其余组给予等量的生理盐水。各组大鼠均饲养在温度(24±1)℃，湿度60%～80%的环境中。

1.3测量各组大鼠阴茎海绵体内压(intracavernous pressure，ICP)和血清睾酮水平

称取适量戊巴比妥钠，用生理盐水稀释成2%的溶液。腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉完全后，将大鼠仰卧位固定四肢和头部。对大鼠颈部消毒后取正中切口，分离颈部肌群，找到并游离右颈总动脉。丝线结扎远心端，近心端使用动脉夹夹闭，在中间取颈动脉小切口，插入充满肝素化生理盐水的PE-50导管，导管另一端连接压力换能器，监测大鼠平均颈动脉压(mean artery pressure，MAP)。消毒大鼠腹部，取腹正中切口，找到大鼠前列腺背外侧的阴茎海绵体神经作为电刺激部位。剥离大鼠阴茎包皮，充分暴露大鼠阴茎海绵体，用充满生理盐水的25号穿刺针斜行刺入大鼠阴茎海绵体中，另一端连接压力换能器，监测大鼠ICP并记录。连接到PowerLab工作台，分别用2.5 V和5 V电压刺激大鼠阴茎海绵体神经(频率15 Hz，波宽1.2 ms，刺激1 min，间隔3 min)，记录ICP和MAP的变化。

大鼠颈动脉测压结束后，颈动脉取血3 mL，用睾酮测定试剂盒测量大鼠血清睾酮水平。处死大鼠，取大鼠阴茎，清除尿道海绵体和阴茎背静脉等组织，用生理盐水冲洗干净后放于-80℃保存。

1.4Western blot检测大鼠阴茎海绵体中S1P2/RhoA/Rho激酶的含量

将大鼠阴茎海绵体用组织剪剪碎后，加入RIPA裂解液。使用超声波破碎蛋白后，放入4℃预冷离心机离心取上清液。用BCA法检测提取蛋白的浓度，取总蛋白量50 μg，放入沸水中10 min。配制10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶准备电泳蛋白，电泳结束后将蛋白转到0.45 nm的PVDF膜上。转膜结束后，将PVDF膜置于5%的BSA溶液中封闭2 h，封闭完成后分别放入对应的抗体中孵育过夜。取出后洗膜3次，每次10 min，然后按照说明书加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗，孵育1 h后再次洗膜3次，每次10 min，采用ECL化学发光并采集图像进行处理，使用Quantity One软件分析图像结果。

1.5统计学分析

2结果

2.1各实验组大鼠生长情况和血清睾酮水平

去势后4组大鼠均饲养8周，其中各组大鼠生长情况良好，无死亡情况出现，查各组大鼠血清睾酮水平B组[(1.34±0.62)nmol/L]较A组[(17.08±1.53)nmol/L]、C组[(15.47±1.62)nmol/L]和D组[(8.73±2.12)nmol/L]明显降低(均P<0.05)。见图1。

A组为对照组，B组为实验组，C组为补充雄激素(20 mg/kg)组，D组为补充雄激素(10 mg/kg)组；与B组比较，*P<0.05图1　各组大鼠血清睾酮水平(n=10)Fig.1 The level of serum testosterone in rats in each group(n=10)

2.2大鼠海绵体测压结果分析

分别用2.5 V和5 V电压刺激大鼠海绵体神经后，MaxICP/MAP结果2.5 V电压刺激时B组(0.14±0.03)较A组(0.77±0.04)、C组(0.76±0.03)和D组(0.36±0.03)显著降低(均P<0.05)；5 V电压刺激时B组(0.19±0.03)较A组(0.83±0.04)、C组(0.82±0.04)和D组(0.47±0.04)显著降低(均P<0.05)。图2是各组大鼠在2.5 V和5 V刺激下海绵体测压的ICP和MAP的监测记录和比较结果。

A：各组大鼠ICP和MAP监测记录；B：各组大鼠MaxICP/MAP结果(n=10)；A组为对照组，B组为实验组，C组为补充雄激素(20 mg/kg)组，D组为补充雄激素(10 mg/kg)组；与B组比较，*P<0.05图2　各组大鼠在2.5 V和5 V电压刺激下大鼠的ICP和MAP结果(n=10)Fig.2 Results of ICP and MAP in rats stimulated with voltage at 2.5 V and 5 V(n=10)

2.3Western blot检测各组大鼠阴茎海绵体中S1P2/RhoA/ROCK通路的蛋白表达

结果显示：B组S1P2、RhoA、ROCK1和ROCK2较A组、C组和D组明显增高(均P<0.05)，见图3。

A组为对照组，B组为实验组，C组为补充雄激素(20 mg/kg)组，D组为补充雄激素(10 mg/kg)组；与B组比较，*P<0.05图3　Western blot检测各组大鼠阴茎海绵体S1P2/RhoA/ROCK1/ROCK2蛋白表达水平(n=10)Fig.3 Western blot analysis of the expression of S1P2/RhoA/ROCK1/ROCK2 in the corpus cavernosum of rats(n=10)

3讨论

阴茎海绵体内皮细胞完整是阴茎正常勃起的保证[10]。完整的海绵体内皮细胞不仅分泌血管舒张因子，而且分泌血管收缩因子，以调节阴茎的正常勃起及疲软[10-12]。目前已有研究表明睾酮缺乏会直接或间接导致内皮功能障碍[7，13-14]。内皮细胞功能障碍的产生主要包括舒张血管因素减少和收缩血管因素增多：舒张血管的因素如eNOS及NO产生减少，而收缩血管的因素如内皮素(endothelins，ETs)和RhoA/Rho激酶产生增多，导致正常阴茎海绵体舒张与收缩的平衡打破，最终导致ED[15-16]。

临床研究表明，睾酮替代治疗可以显著改善血清睾酮水平较低的患者的勃起功能，但是其具体机制尚不清楚，目前关于睾酮替代治疗改善勃起功能的机制研究多集中于eNOS途径，而睾酮替代治疗是如何影响阴茎海绵体内的RhoA/Rho激酶途径，从而发挥改善勃起功能的作用，相关研究较少。

RhoA/Rho激酶信号通路参与调控细胞增殖与凋亡、细胞形态维持、平滑肌收缩等多种生物学行为。RhoA是三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)酶的家族成员之一，主要以非活化的状态与二磷酸鸟苷(guanosine diphosphate，GDP)结合，当GDP转化成GTP后，RhoA从细胞质转移到细胞膜，进而激活其下游的信号分子：ROCK1和ROCK2。它们可以不依赖细胞内Ca2+浓度促进肌动蛋白和肌球蛋白的交联导致阴茎海绵体平滑肌的收缩[17-18]。在阴茎非勃起状态下，RhoA/Rho激酶信号途径通过抑制肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)的活性，催化肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)磷酸化水平增高，使阴茎海绵体平滑肌处于收缩状态；而在勃起时，RhoA/Rho激酶信号途径被抑制，从而引起海绵体平滑肌舒张[19-20]。

S1P是一种具有重要生理功能的信使分子，主要由血小板和红细胞产生。它拥有5个G蛋白偶联受体，为S1P1～S1P5，现有研究表明S1P2在人阴茎海绵体平滑肌细胞上有表达，当S1P结合S1P2受体后可以激活RhoA/Rho激酶途径，进而使阴茎海绵体平滑肌收缩[8]。在用S1P诱导阉割大鼠的阴茎海绵体平滑肌肌条收缩的实验中，发现随着S1P剂量的增加及时间的延长，肌条收缩力随之增大，然而，当用S1P诱导正常大鼠的阴茎海绵体平滑肌肌条收缩时，却未见肌条明显收缩[8]。以上的实验研究结果可能是因为雄激素缺乏后，海绵体平滑肌上的S1P2受体增加，对S1P的敏感性增加，导致海绵体平滑肌强烈收缩，因此我们在实验中提出了假设：雄激素缺乏将激活S1P/S1P2信号通路，进而激活RhoA/Rho激酶途径，导致ED；当给予雄激素替代治疗后，以上异常激活途径将会被纠正，进而改善ED。

从实验结果来看，B组的血清睾酮水平明显低于其他组；相应的海绵体测压的结果显示B组相较于其他组显著降低，低剂量的D组大鼠的勃起功能有所改善，但是还未达到正常水平，而高剂量的C组大鼠的勃起功能基本恢复正常，说明应用安特尔进行雄激素替代治疗确实可以改善去势大鼠的勃起功能；Western blot的结果显示相比于其他组，B组S1P2、RhoA、ROCK1和ROCK2水平显著升高，可知睾酮缺乏可以使S1P2表达上调，进而使RhoA/Rho激酶通路异常激活，引起阴茎海绵体平滑肌收缩，最终导致ED；而给予补充睾酮之后，这种异常激活途径被纠正，S1P2表达下调，使RhoA/Rho激酶通路蛋白表达下降，从而改善ED。综合来看，本实验结论有助于阐明安特尔发挥作用的具体方式，并且为研究雄激素替代治疗改善LOH相关ED的机制提供新的思路。

参考文献

[1]刘继红，栾阳.男性勃起功能障碍的分子生物学研究进展[J].中华男科学杂志，2015，21(2)：99-106.

[2]Feldman H A，Goldstein I，Hatzichristou D G，et al.Impotence and its medical and psychosocial correlates：Results of the massachusetts male aging study[J].J Urol，1994，151(1)：54-61.

[3]Lunenfeld B.Aging men—challenges ahead[J].Asian J Androl，2001，3(3)：161-168.

[4]Nieschlag E，Swerdloff R，Behre H M，et al.Investigation，treatment，and monitoring of late-onset hypogonadism in males：ISA，ISSAM，and EAU recommendations[J].J Androl，2006，27(2)：135-137.

[5]Wu F C，Tajar A，Beynon J M，et al.Identification of late-onset hypogonadism in middle-aged and elderly men[J].N Engl J Med，2010，363(2)：123-135.

[6]Traish A，Kim N.The physiological role of androgens in penile erection：regulation of corpus cavernosumstructure and function[J].J Sex Med，2005，2(6)：759-770.

[7]Yu J，Akishita M，Eto M，et al.Androgen receptor-dependent activation of endothelial nitric oxide synthase in vascular endothelial cells：role of phosphatidylinositol 3-kinase/akt pathway[J].Endocrinology，2010，151(4)：1822-1828.

[8]Zhang X H，Melman A，Disanto M E.Update on corpus cavernosum smooth muscle contractile pathways in erectile function：a role for testosterone?[J].J Sex Med，2011，8(7)：1865-1879.

[9]李铮，郑松，智玲梅,等.雄激素对阿朴吗啡和电刺激诱导的去势大鼠勃起功能的影响[J].生殖医学杂志，2002，11(3)：153-157.

[10]Aversa A，Bruzziches R，Francomano D，et al.Endothelial dysfunction and erectile dysfunction in the aging man[J].Int J Urol，2010，17(1)：38-47.

[11]Freestone B，Krishnamoorthy S，Lip G Y.Assessment of endothelial dysfunction[J].Expert Rev Cardiovasc Ther，2010，8(4)：557-571.

[12]Van den Oever I A，Raterman H G，Nurmohamed M T，et al.Endothelial dysfunction，inflammation，and apoptosis in diabetes mellitus[J].Mediat Inflamm，2010，2010(1)：792393.

[13]HamidiMadani A，Heidarzadeh A，Akbari Parsa N，et al.A survey on relative frequency of metabolic syndrome and testosterone deficiency in men with erectile dysfunction[J].Int Urol Nephrol，2012，44(3)：667-672.

[14]Chao J K，Kuo W H，Chiang H S，et al.Association of metabolic syndrome，atherosclerosis risk factors，sex hormones in ED in aboriginal Taiwanese[J].Int J Impot Res，2012，24(4)：141-146.

[15]Ryan J G，Gajraj J.Erectile dysfunction and its association with metabolic syndrome and endothelial function among patients with type 2 diabetes mellitus[J].J Diabetes Complications，2012，26(2)：141-147.

[16]Gur S，Kadowitz P J，Hellstrom W J.A critical appraisal of erectile dysfunction in animal models of diabetes mellitus[J].Int J Androl，2009，32(2)：93-114.

[17]Chitaley K，Webb R C，Mills T M.RhoA/Rho-kinase：A novel player in the regulation of penile erection[J].Int J Impot Res，2001，13(2)：67-72.

[18]Li M，Zhuan L，Wang T，et al.Apocynin improves erectile function in diabetic rats through regulation of NADPH oxidase expression[J].J Sex Med，2012，9(12)：3041-3050.

[19]Corona G，Maggi M.The role of testosterone in erectile dysfunction[J].Nat Rev Urol，2010，7(1)：46-56.

[20]李瑞，孟祥虎，张岩，等.p47phox在高脂血症白兔阴茎海绵体平滑肌中的表达及其意义[J].华中科技大学学报：医学版，2014，43(1)：45-47，58.

(2015-09-16收稿)

Androgen Improves Erectile Dysfunction by Regulating RhoA/Rho-kinase in Castrated Rats

Cui Kai1，2，Li Rui1，2，Wang Tao1，2etal

1DepartmentofUrology，2InstituteofUrology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo investigate the mechanism of androgen regulating RhoA/Rho-kinase to improve erectile dysfunction in castrated rats.MethodsForty eight-week-old healthy male SD rats were randomly divided into 4 groups：control group(group A)；experiment group(group B，in which rats were castrated)；intervention groups(groups C and D，in which rats were treated with different concentrations of testosterone undecanoate orally every day at 20 mg/kg and 10 mg/kg，respectively after being castrated).Animals in groups A and B were given 0.9% NS instead.After 8-week treatment，the level of serum testosterone，intracavernous pressure(ICP)and mean arterial pressure(MAP)were determined，and the expression of S1P2/RhoA/Rho-kinase detected in the penis by Western blot.ResultsThe level of serum testosterone was significantly lower in group B[(1.34±0.62)nmol/L]than in group A[(17.08±1.53)nmol/L]，group C[(15.47±1.62)nmol/L]and group D[(8.73±2.12)nmol/L](P<0.05 for all)；MaxICP/MAP was also lower in group B than in group A，group C and group D(P<0.05 for all)；the expression levels of S1P2/RhoA/Rho-kinase were higher in group B than in groups A，C and D(P<0.05 for all).ConclusionAndrogen replacement therapy can improve the erectile dysfunction by inhibiting the activation of S1P2/RhoA/Rho-kinase and thereby inhibiting the contraction of corpus cavernosum smooth muscle.

Key wordsRhoA/Rho-kinase；androgen；castration；erectile dysfunction

中图分类号：R698.1

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.006

*国家自然科学基金资助项目(No.81200435)；中华医学会临床医学科研专项资金资助项目(No.14020180555)

崔凯，男，1990年生，医学硕士，E-mail：kaicui1990@yeah.net

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：jhliu@tjh.tjmu.edu.cn(刘继红)；raokeke2009@163.com(饶可)