王志远，李 可，庞楠楠，张 瑞

1.新疆医科大学第五附属医院消化内科，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学第一附属医院血液病中心

白介素-6、核周型抗中性粒细胞胞浆抗体与抗酿酒酵母抗体在克罗恩病中的临床价值

王志远1，李 可1，庞楠楠2，张 瑞2

1.新疆医科大学第五附属医院消化内科，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学第一附属医院血液病中心

目的 探讨白介素-6(IL-6)、核周型抗中性粒细胞胞浆抗体(pANCA)与抗酿酒酵母抗体(ASCA)在克罗恩病(Crohn’s disease，CD)中的诊断价值。方法 共有CD患者67例，健康对照者30名。分别用间接免疫荧光法(IIF)测定pANCA，酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-6和ASCA，计算各项指标在CD及其亚型中的灵敏度、特异度及阳性预测值，并进行统计学分析。结果 CD活动期患者血清IL-6水平显著高于缓解期及健康对照组，且与病情严重程度呈正相关。pANCA在CD组与健康对照组中灵敏度差异无统计学意义(P>0.05)。ASCA、ASCA IgA和ASCA IgG在两组中阳性率差异均有统计学意义(χ2=16.58、5.69、14.09，P均<0.05)，单项检测ASCA IgA、ASCA IgG，两种方法间差异无统计学意义(P>0.05)。联合检测IL-6、pANCA和ASCA可以提高CD诊断的灵敏度、特异度和阳性预测值，对阳性率影响不大。CD各亚型中pANCA、ASCA灵敏度组间差异均无统计学意义(P>0.05)，两种抗体与病情严重程度无明显相关。结论 促炎因子IL-6与CD病情进展相关，对CD的诊断和临床评估具有重要意义。ASCA可以作为CD诊断的一个重要血清学指标，而pANCA对CD的诊断价值相对较小。

克罗恩病；白介素-6；抗中性粒细胞胞浆抗体；抗酿酒酵母抗体

克罗恩病(Crohn’s disease，CD)是消化内科的常见疾病之一，与溃疡性结肠炎、肠结核、大肠癌等肠道疾病相比，CD发病率相对较低。虽没有长期的流行病学调查资料，但近年来CD发病率有明显上升趋势[1]。目前的研究[2]认为CD的发生可能与遗传因素、炎症反应及肠黏膜对各种抗原刺激产生的免疫反应有关。副结核分支杆菌、侵袭性大肠杆菌已被证实参与CD肠道炎性反应和继发感染，临床上患者常出现间歇性低热或中等度热。白介素-6(interleukin-6，IL-6)作为一种重要的炎症因子，在机体的炎性介质反应中发挥重要作用。已有学者[3]发现IL-6在炎症性疾病诊断方面具有一定价值，有较高的特异度和灵敏度。核周型抗中性粒细胞胞浆抗体(perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies，pANCA)和抗酿酒酵母抗体(anti-saccharomyces cerevisiae antibodies，ASCA)参与炎症性肠病体液免疫，但两种抗体作用机制仍不明确。关于pANCA与ASCA在CD中的研究，国内外已有相关报道，然而由于样本容量有限、地域差异较大，研究结论尚未统一，也不乏矛盾之处。目前也尚未见炎症因子、血清学抗体联合检测的相关报道。因此本研究拟通过联合检测CD患者中IL-6、pANCA、ASCA水平，探讨其在CD中的临床作用，为疾病的诊疗提供更多的思路和方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年1月-2015年1月在新疆医科大学第一附属医院、第五附属医院、自治区人民医院确诊的门诊及住院部CD患者67例。诊断标准：参照《2010年世界胃肠病学组织关于炎症性肠病诊断和治疗的实践指南》[4]，即通过临床表现、影像学检查、肠镜检查、黏膜组织学检查、切除标本和排除其他肠道疾病等要点进行综合诊断。排除标准：排除溃疡性结肠炎、肠结核、白塞病、缺血性肠病、显微镜下结肠炎、阿米巴痢疾、药物性肠病、嗜酸性细胞肠炎、憩室炎、恶性淋巴瘤和癌等疾病。CD患者中，男42例，女25例，年龄22～65岁，平均年龄(35.1±10.8)岁。根据2005年Montreal分型标准[5]可对CD患者进行亚型分组，按诊断年龄分为：A1组(≤16岁)、A2组(17～40岁)、A3组(≥40岁)；按病变部位分为：L1组(回肠末端)、L2组(结肠)、L3组(回结肠)、L4组(上消化道)；按疾病行为分为：B1组(炎症性)、B2组(狭窄)、B3组(穿透)。CD病情严重程度可根据Best CDAI评分标准分为缓解期(CDAI<150分)、活动期(≥150分)，其中轻度活动期(150～220分)、中度活动期(221～450分)、重度活动期(>450分)。选取同期在新疆医科大学第五附属医院体检的健康人群30名作为健康对照组，男17名，女13名，年龄15～65岁，平均年龄(32.3±14.4)岁，排除近期感染、结缔组织病、长期使用质子泵抑制剂(PPI)、非甾体抗炎药(NASIDs)者。CD组与对照组均经过详细询问病史、体格检查及相关辅助检查，所有研究对象均签署知情同意书。两组性别、平均年龄相比差异无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。

1.2 实验方法 采集CD组与对照组清晨空腹血4 ml，3 000 r/min离心10 min(离心半径10 mm)，收集血清冻存于-80 ℃冰箱待检。

IL-6测定：IL-6试剂盒购自美国R&D公司，试验方法应用酶联免疫吸附测定(ELISA)。分别设立标准孔、待测孔、空白孔，将血清样本稀释5倍后，加于待测孔。室温孵育30 min，反复洗涤，每孔加入显色剂混匀，最后加入终止液50 μl。在450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。制作OD值标准曲线，计算相应浓度。IL-6正常值范围0～7 pg/ml。

pANCA血清学测定：pANCA试剂盒购自美国ATCC公司，试验方法采用间接免疫荧光法(IIF)。将血清按1∶10稀释，取20 μl滴加于乙醇固定的中性粒细胞生物薄片，另取阳控、阴控各20 μl作为对照，孵育30 min，用PBS缓冲液冲洗5～10 min。在薄片洁净反应区滴加20 μl荧光标记的羊抗人IgG结合物，孵育30 min后用PBS缓冲液洗涤10～15 min。封片后，应用倒置荧光显微镜观察结果，阴性参考值为pANCA<20 RU/ml。

ASCA IgA/IgG血清学测定：ASCA IgA/IgG试剂盒购自美国INOVA公司，试验采用ELISA法。梯度稀释标准品，制备标准曲线，酶标板中加入患者血清，每个样本3个复孔，实验中设置阳性对照孔和阴性对照孔，室温下孵育。加入与辣根过氧化物酶共轭的羊抗人IgA/IgG结合物，洗涤后加入100 μl底物，避光室温15 min。加入终止液后在450 nm光度计上测定吸光度，根据公式计算出抗体量。样本抗体量=样本OD值/低阳性率OD×25。阴性参考值为ASCA IgA<20.0 EU/ml，ASCA IgG<40.0 EU/ml。

2 结果

2.1 CD组与健康对照组IL-6水平比较 CD缓解期IL-6水平高于健康对照组，差异有统计学意义(t=3.695，P<0.05)；CD活动期IL-6水平高于健康对照组，差异有统计学意义(t=16.523，P<0.05)；轻度活动期、中重度活动期IL-6水平均高于缓解期，差异有统计学意义(t=12.622、25.373，P均<0.05)；轻度活动期IL-6水平低于中、重度活动期，差异有统计学意义(t=7.376，P<0.05，见表1)。

2.2 CD组与健康对照组pANCA与ASCA水平比较 健康对照组中pANCA阳性率为16.7%，ASCA阳性率为13.3%，ASCA IgA阳性率为13.3%，ASCA IgG阳性率为0。单项检测pANCA在CD组与健康对照组中阳性率差异无统计学意义(χ2=0.103，P>0.05)。单项检测ASCA在CD组与健康对照组中阳性率差异有统计学意义(χ2=16.58，P<0.005)。单项检测ASCA IgA或ASCA IgG，其在CD组及健康对照组中阳性率差异有统计学意义(ASCA IgA：χ2=5.69，P<0.05；ASCA IgG：χ2=14.09，P<0.005)，而两种方法之间差异无统计学意义(χ2=3.39，P>0.05)。

单项检测pANCA、ASCA的比较：CD组中ASCA阳性率显著高于pANCA，差异有统计学意义(χ2=14.70，P<0.005)。联合检测pANCA、ASCA：CD组中ASCA+/pANCA-阳性率为57.3%(小于单独检测ASCA阳性率58.2%)，灵敏度为66.7%，特异度为89.3%，阳性预测值为92.3%(见表2)。

2.3 联合检测IL-6、pANCA、ASCA 相比单独检测，三者联合测定可以提高结果的灵敏度、特异度和阳性预测值(见表2)。

2.4 pANCA、ASCA在CD亚型中的检测 pANCA在CD各亚型中阳性率、灵敏度、特异度、阳性预测值均偏低；ASCA在大多数CD亚型中具有较高的特异度和阳性预测值，灵敏度显著高于pANCA；ASCA IgA灵敏度较低，但具有较高的特异度和阳性预测值；ASCA IgG灵敏度明显高于ASCA IgA，且特异度、阳性预测值均为100%，高于上述抗体。CD各亚型中，单项检测pANCA、ASCA、ASCA IgA、ASCA IgG的灵敏度和阳性预测值组间差异均无统计学意义(P均>0.05)。CD病变主要累及回肠末端与右侧邻近结肠(L1+L3)，与病变位于结肠者(L2)相比，各抗体阳性率差异均无统计学意义(P均>0.05)，且非并发症组(B1)与并发症组(B2+B3)阳性率差异亦无统计学意义(P均>0.05)，各抗体与疾病活动性无明显相关(P均>0.05，见表3～4)。

表1 CD组与健康对照组中IL-6水平比较Tab 1 Comparison of IL-6 levels between CD group and healthy control group ±s,pg/ml)

表2 IL-6、pANCA、ASCA及其组合对CD的评价指标比较(%)Tab 2 Comparison of evaluation indexes of IL-6,pANCA,ASCA and their combination in CD group (%)

表3 CD各亚型中pANCA、ASCA阳性率/灵敏度比较[n(%)]Tab 3 Comparison of positive rates or sensitivity of pANCA and ASCA in CD subtypes[n(%)]

表4 CD各亚型中pANCA、ASCA特异度、阳性预测值比较(%)Tab 4 Comparison of specificity and positive predictive value of pANCA and ASCA in CD subtypes (%)

3 讨论

CD作为一种病因复杂的炎症性肠病，缺乏诊断金标准，临床上有较高的漏诊率和误诊率。对CD的诊断及鉴别诊断依然是现阶段研究的重点与难点，随着病情不断发展，CD患者易出现管腔狭窄、穿孔等并发症，预后较差，因此早期诊断与治疗尤为关键。

CD属于慢性非特异性炎性肉芽肿性疾病，炎性细胞因子在其发生、发展过程中具有相当重要的作用。IL-6由激活的巨噬细胞产生，兼备促炎与抗炎两种生物学功能。一方面，IL-6对机体多种细胞都具有较为普遍的促炎作用，在急性炎症反应期能够直接参与到炎症损伤过程中[6]。IL-6诱导中性粒细胞分泌和增殖，促进肠上皮细胞分泌电解质，使内皮细胞通透性增加，炎性细胞透过血管浸润至肠道黏膜，加重CD病情。另一方面，IL-6参与机体免疫反应，诱导特异性抗体的产生，如IL-6可以刺激浆细胞产生抗体，参与免疫应答，抑制炎症反应，这些机制与炎症性肠病的发生息息相关[7]。有研究[8]证实，IL-6可渐进性加重结肠炎症，容易使CD患者并发瘘管、狭窄、穿孔等严重并发症，且CD活动期IL-6水平明显高于健康人群。国外学者[9]报道，CD患者病理活检标本中IL-6水平高于疾病对照组及正常对照组，与内镜下炎症分级呈正相关，本研究与该文献报道一致，随着疾病活动性增加，IL-6表达水平也逐渐上调，说明高水平的IL-6与病情重、预后差有关，IL-6可能是一种重要的评估CD病情严重程度的细胞因子。

pANCA与ASCA作为炎症性肠病血清学抗体的经典组合，已被广泛运用到临床协助CD诊断与病情评估，然而不同报道间却存在较大差异。在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)患者中pANCA灵敏度为50%～67%，特异度为75%～94%。而ASCA在CD患者中阳性率可达39%～72%，特异度为82%～89%，显著高于UC患者[10]。然而ASCA检测缺乏一定的敏感度与特异度，限制其对CD的诊断作用[11]。本研究中，CD患者ASCA阳性率、特异度、阳性预测值均显著高于pANCA，与文献[12]报道一致，说明ASCA在CD诊断方面较pANCA更为敏感，可以作为CD诊断的一个重要血清学指标，而pANCA对CD的诊断价值相对较小。值得一提的是，联合检测ASCA IgA与ASCA IgG可以提高ASCA的诊断，联合测定pANCA与ASCA可以提高CD诊断的灵敏度、特异度和阳性预测值，对阳性率影响不大。因此相对于单项检测，联合抗体测定对CD的诊断更有帮助。

Coukos等[13]发现pANCA参与炎症性肠病并发的憩室炎，而ASCA与CD病情发展密切相关。pANCA阳性CD患者经激素等治疗后，pANCA滴度较治疗前无明显变化，其与并发症、病情程度无相关性，提示pANCA可能反映机体免疫调节紊乱状态，而对疾病本身无直接作用。而ASCA阳性者手术治疗后发生瘘和结肠袋的风险显著高于阴性者，以ASCA IgA最为显著。本试验中pANCA阳性者13例，8例接受正规治疗，其中病变位于结肠者5例，口服布地奈德、氨基水杨酸制剂，病变位于回结肠者5例，口服布地奈德、柳氮磺吡啶，1例后因不能耐受，改用甲氨蝶呤肌注，另有1例行手术治疗，所有8例患者治疗2周后复查pANCA仍为阳性，未见ASCA阳性患者术后出现瘘管。Rieder等[14]发现随着CD病情不断发展，ASCA水平会发生显著波动，但ASCA并不会由阳转阴。Solberg等[15]也指出CD患者ASCA水平在诊断及治疗2年后较稳定，滴度无明显变化。本研究尚未对随访人群进行ASCA检测，有待延长随访时间进一步复查。

Eser等[16]指出ASCA IgA或IgG在CD患者中的检出率为60%～70%，可以预测CD表型及病情严重程度，特别是病变位于回肠者具有较高的阳性率。Ryan等[17]也提出同样观点，认为ASCA阳性率高与回肠CD密切相关。本研究中，回结肠与回肠末端ASCA阳性率均略高于结肠和上消化道，但组间差异无统计学意义。因此，要证明ASCA与CD回肠间的相关性，需要扩大样本量随访观察。本研究显示血清学抗体检测不能有效预测CD亚型，这与Lichtenstein等[18]的研究结论一致。

综上所述，pANCA与ASCA检测最大的缺陷在于其较低的灵敏度，无法预测CD病情的活动度，尚有待新的方法进一步提高其诊断效力。而IL-6不仅参与CD的发生，其在CD病变肠黏膜组织中表达水平的高低还与疾病的严重程度相关。因此，联合检测IL-6、pANCA、ASCA对CD的诊断及病情评估具有重要意义。目前国内外关于细胞因子与血清学抗体在CD治疗、预后等方面的研究相对较少，也缺乏大样本量的前瞻性研究。IL-6、pANCA与ASCA在CD中的作用机制及诊断价值有待进一步研究，以期指导临床。

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(责任编辑：陈香宇)

Clinical significance of interleukin-6,perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies and anti-saccharomyces cerevisiae antibodies in Crohn’s disease

WANG Zhiyuan1,LI Ke1,PANG Nannan2,ZHANG Rui2

1.Department of Gastroenterology,the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumchi 830000; 2.Centre of Hematopathy,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,China

Objective To evaluate the clinical significance of interleukin-6 (IL-6),perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies (pANCA) and anti-saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) in Crohn’s disease (CD).Methods A total of 67 patients with CD and 30 healthy volunteers as healthy control group were recruited in this study. pANCA was detected by indirect immunofluorescence assay (IIF),ASCA and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),the sensitivity,specificity and positive predictive value of all CD subtypes were calculated.Results The serum IL-6 in active CD patients was higher than that in remission CD patients and healthy controls (P<0.05),the serum IL-6 was positively related with CD severity. The sensitivities of pANCA had no significant difference between CD group and healthy control group (P>0.05). There were significant differences in the sensitivities of ASCA,ASCA IgA and ASCA IgG between two groups (χ2=16.58,5.69,14.09,P<0.05). ASCA IgA or ASCA IgG detection alone had no significant difference between two methods (P>0.05). Combined detection of IL-6,pANCA with ASCA could improve the sensitivity,specificity and positive predictive value of diagnosis,and cause little impact to positive rate. There was no significant difference in sensitivities of pANCA and ASCA among the subtype groups of CD (P>0.05). Both two antibodies had no clear relativity in the severity of CD.Conclusion The pro-inflammatory cytokines like IL-6 is correlated with CD severity,which is very imperative for diagnosis and clinical appraisal of CD. ASCA is a significant serous antibody for CD and it has certain value for diagnosis,while the diagnostic value of pANCA is finite.

Crohn’s disease; Interleukin-6; Perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies; Anti-saccharomyces cerevisiae antibodies

王志远，硕士研究生，研究方向：胃肠疾病。E-mail：wzy03181@163.com

李可，主任医师，副教授，研究方向：胃肠及肝胆疾病。E-mail：774525211@qq.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.026

R574.62

A

1006-5709(2016)04-0452-05

2015-05-23