吴洪秋， 张永良， 黄坚尧， 张汉运

珠海市妇幼保健院医学检验科，广东 珠海 519001

乙肝血清学标志物定量和HBV DNA定量联合检测在乙肝病毒感染诊断中的应用

吴洪秋， 张永良， 黄坚尧， 张汉运

珠海市妇幼保健院医学检验科，广东 珠海 519001

目的 分析乙肝患者的血清标志物和乙肝病毒(HBV)DNA联合检测在HBV感染诊断中的应用价值。方法 以2013年6月-2015年6月在珠海市妇幼保健院就诊的120例乙肝患者血清样本作为研究资料，分别采用ELISA定性试验和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测HBV血清标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)和HBV DNA含量。结果 Ⅰ组HBV DNA阳性率为96.15%；Ⅱ组HBV DNA阳性率为48.08%；Ⅲ组HBV DNA阳性率为4.76%。Ⅰ组HBV DNA定量显著高于Ⅱ、Ⅲ两组(P<0.01)；Ⅱ组HBV DNA定量显著高于Ⅲ组(P<0.05)。HBV DNA与HBsAg检出符合率分别为73.33%和72.50%，两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 乙肝血清标志物定量与HBV DNA定量联合检测在诊断HBV感染过程中起互相补充的作用，诊断结果更加准确，可提供更有效的参考依据。

血清学标志物；HBV DNA；乙肝病毒；定量检测

世界卫生组织最新统计显示，目前全球有2.4亿人是慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者，而每年约有78万人死于HBV感染相关并发症，可见乙肝已经严重威胁了人类健康与生活[1]。研究[2]表明，HBV血清学标志物检测和HBV DNA定量检测是目前普遍接受和公认的诊断与判断HBV感染程度及传染性的两种主要方法。血清学标志物检测方法简单方便，能够快速地获得结果，可用于乙肝的大批量筛查，但它不能充分反映HBV复制情况。HBV DNA定量检测可直接、灵活地监测血清中HBV DNA的复制情况，能清楚地区别乙肝不同时期的感染，也可准确地诊断乙肝的突变株。但是目前利用乙肝血清学标志物定量和HBV DNA定量联合检测乙肝的相关研究较少，无法提高HBV感染诊断的准确率。因此，本研究对120例乙肝患者的血清学标志物定量和HBV DNA定量联合检测，探讨两者联合在HBV感染中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年6月-2015年6月在珠海市妇幼保健院住院及门诊就诊的120例乙肝患者作为研究对象，男80例，女40例，年龄10～72岁，平均年龄(38.5±4.5)岁。120例患者根据HBV水平分为三组，Ⅰ组-“大三阳组，即HBsAg、HBeAg、抗HBc阳性，Ⅱ组-“小三阳组，即HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性，Ⅲ组-其他模型组，即抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc阳性，抗-HBs、抗-HBc阳性，抗-HBe、抗-HBc阳性，抗-HBc阳性，抗-HBs阳性，HBsAg及全阴性等。3组的性别、年龄等临床资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：符合国家卫生部(GB15990-1995)制定的乙型病毒性肝炎的诊断标准者；年龄为10～72岁乙肝患者；无严重心血管疾病或肝部患有肿瘤及囊肿者；近期未接受抗病毒治疗者。排除标准：排除患有精神疾病或严重的心脑血管疾病者；排除肝部患有恶性肿瘤或囊肿等病症者；近期接受抗病毒治疗者。

1.3 实验材料 乙型肝炎血清标志物ELISA定性试剂盒购于上海博耀生物科技有限公司；HBS-1096A酶标分析仪购于南京德铁实验设备有限公司；IQ5型荧光定量PCR仪购于美国Bio-Rad公司，实时荧光定量PCR试剂及试剂盒购于上海泸鼎生物科技有限公司。

1.4 方法 所有患者在清晨空腹抽取静脉血，静置3 h后，离心分离血清，-20 ℃保存待测。血清学标志物的定量检测：采用人乙肝血清学标志物ELISA定性试剂盒予以检测，所有操作及结果判断均严格按照试剂盒的说明书操作进行。HBV DNA定量检测：(1)取100 μl血清加入100 μl DNA浓缩液，充分混匀，离心10 min(12 000 r/min)，弃上清，在管底沉淀中加入20 μl HBV DNA提取液，剧烈振荡充分混匀，恒温煮沸10 min，离心8 min(12 000 r/min)，取上清备用；(2)取PCR反应管，相应地加入处理后的样品及标准品各2 μl，离心30 s(5 000 r/min)，放入仪器样品槽；(3)设反应参数如下：93 ℃预变性2 min，1个循环；94 ℃变性30 s，40个循环；94 ℃→60 ℃退火、延伸30 s，40个循环；(4)仪器读取荧光值。

1.5 观察指标与诊断标准 观察HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc和HBV DNA水平。血清学标志物定量检测的判断标准[3]：HBsAg浓度≥0.2 ng/ml为阳性，<0.2 ng/ml为阴性。抗-BHs浓度≥10.00 mIU/ml为阳性，<10.00 mIU/ml为阴性。HBeAg浓度≥0.5 PEIU/ml为阳性，<0.5 PEIU/ml为阴性。抗-HBe浓度≥0.3 PEIU/ml为阳性，<0.3 PEIU/ml为阴性。抗-HBc浓度≥0.9 PEIU/ml为阳性，<0.9 PEIU/ml为阴性。HBV DNA定量检测的判断标准[4]：HBV DNA浓度≥5.0 lg copies/ml为阳性，<5.0 lg copies/ml为阴性。

2 结果

2.1 HBV DNA的检测结果 HBV DNA的检测结果显示，I组26例，HBV DNA阳性25例，阳性率为96.15%；Ⅱ组52例，HBV DNA阳性25例，阳性率为48.08%；Ⅲ组42例，HBV DNA阳性2例，阳性率为4.76%。与Ⅲ组比较，I组和Ⅱ组的HBV DNA阳性检出率均明显升高(P<0.05)；与Ⅱ组比较，I组的HBV DNA阳性检出率明显升高(P<0.05)。I组、Ⅱ组和Ⅲ组的HBV DNA定量结果分别为(7.29±1.40)lg copies/ml、(4.39±1.38)lg copies/ml和(3.60±1.71)lg copies/ml。与Ⅲ组比较，I组和Ⅱ组的HBV DNA定量结果均明显升高(P<0.05)；与Ⅱ组比较，Ⅰ组的HBV DNA定量结果明显升高(P<0.05)。

2.2 HBV DNA与血清标志物阳性率的比较 HBV DNA与血清标志物阳性率检测结果如表1所示，在52例HBV DNA阳性标本中，HBsAg检出率为96.15%(50/52)，HBeAg检出率为46.15%(24/52)，提示HBV DNA阳性患者大多为HBsAg携带者。同时，HBV DNA的检出符合率为73.33%(88/120)，HBsAg的检出符合率为72.50%(87/120)，两者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 患者HBV DNA和血清标志物阳性率对比Tab 1 Comparison of HBV DNA and serum markers positive rate in patients

2.3 不同血清学模式的HBV DNA测定结果 在不同HBV DNA含量范围内的不同标志物模式测定结果如表2所示，HBV DNA的含量在2.7～5 lg copies/ml区间，以“HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性”居多，占60.87%(14/23)；在5～7 lg copies/ml区间，以“HBsAg、HBeAg、抗HBc阳性”居多，占63.63%(7/11)，“HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性”占36.36%(4/11)；而在>7 lg copies/ml区间中，则主要是“HBsAg、HBeAg、抗HBc阳性”模式，占83.33%(15/18)。

表2 不同血清学模式的HBV DNA测定结果[例数(%)]Tab 2 HBV DNA results of different serological patterns[n(%)]

3 讨论

研究[5]认为，在HBV感染人体的过程中，机体的免疫应答会产生免疫杀伤的作用，而免疫功能的强弱则决定HBV感染的程度及病程的归转。在机体免疫功能低的情况下，HBV会持续复制，并分泌HBeAg；而在机体免疫功能高或患者病情好转时，HBV则会停止复制，HBeAg呈阴性，抗-HBe呈阳性。研究[6]表明，乙肝血清学标志物可反映机体感染HBV时的免疫状态，而HBV DNA则可最直接、可靠地反映乙肝病毒的复制活动，因此，目前认为乙肝血清学标志物和分子生物学检测HBV DNA是诊断HBV感染的重要依据。

乙肝血清学标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)检测多使用ELISA法，它具有快速、价廉、简便的特点，能够间接反映HBV感染，基本满足临床诊断的需要，但不能及时、动态地反映HBV的复制情况及其传染的危险性。而荧光定量PCR检测HBV DNA，可弥补乙肝血清学标志物检测的不足[7]。因此，本研究旨在探讨乙肝血清学标志物定量和HBV DNA定量联合检测在HBV感染诊断中的应用及其价值。

本研究结果显示，I组HBV DNA定量检测阳性率高达96.15%，显著高于Ⅱ组(48.08%)及Ⅲ组(4.76%)的阳性检出率，且HBV DNA水平也明显高于Ⅱ、Ⅲ组，差异有统计学意义，这与前人报道[8-9]的结果基本一致，提示HBeAg阳性患者体内HBV复制活跃，传染性较强。在52例HBV DNA阳性病例中，HBsAg检出率为96.15%，HBeAg检出率为46.15%，提示HBV DNA阳性患者大多为HBsAg携带者，而HBV DNA与HBsAg的检出符合率之间差异无统计学意义，说明HBeAg值与HBV DNA含量存在一定的关系。在不同血清学模式中，HBV DNA含量>7 lg copies/ml时，I组(大三阳)HBV DNA阳性率，显著高于其他模式，说明HBV DNA与HBeAg高度相关，且呈正相关，一致性较好，即在HBeAg阳性范围内，HBeAg值越高，HBV DNA含量越高，这与杨勇、漆爱红等[10-11]报道的结果一致，提示通过检测HBeAg，可间接判断HBV的复制及传染的活跃程度，但并不意味HBeAg转阴HBV就停止复制。本研究结果显示，HBV DNA含量为5～7 lg copies/ml，Ⅱ组(小三阳)HBV DNA阳性率仍占60.87%，这可能与HBV变异株有关。

有研究[12]报道，当患者血清HBV DNA水平>5 lg copies/ml时，HBV复制较为活跃，而<5 lg copies/ml时，患者处于低度感染状态，因此，在临床上也应同时进行HBV DNA定量检测，充分了解病毒的复制情况。有学者[13]认为，使用PCR技术定量检测HBV DNA水平，能用于HBsAg阴性者HBV感染的早期诊断。同时，PCR方法灵敏度高，可检出低水平的HBV感染，在无法检出HBsAg量的情况下，能够检出可能因S基因突变造成HBV不再表达HBsAg而血清学标志物出现全阴患者的HBV感染情况[14]。此外，国外学者研究[15]证明，在抗病毒诊断、治疗及预后过程中，HBV DNA定量检测可预测患者的血清学转换，对隐匿性和外显性HBV的复制活跃程度、传染性、药物疗效等的判断有重要意义。

综上所述，血清学标志物定量检测可以间接反映HBV的感染情况，但多种血清学标志物为阴性的患者中都出现HBV DNA阳性率，说明HBV DNA定量检测HBV的感染能够很好地补充乙肝血清学标志物定量检测的不足。因此，血清学标志物定量和HBV DNA定量联合检测，能够提高临床诊断HBV的准确率，为临床判断HBV感染程度及传染性提供有效的参考依据，具有重要的临床应用价值。

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(责任编辑：李 健)

The application of combination detection of hepatitis B serological markers quantification and HBV DNA quantification in the diagnosis of hepatitis B virus infection

WU Hongqiu,ZHANG Yongliang,HUANG Jianrao,ZHANG Hanyun

Department of Medical Laboratory Science,Zhuhai Maternal and Child Health Hospital,Zhuhai 519001,China

Objective To analyze the application value of combination detection in the diagnosis of hepatitis B virus (HBV) infection by the quantitative detection of serological markers and HBV DNA of hepatitis B patients.Methods The serum samples of 120 hepatitis B patients from Jun. 2013 to Jun. 2015 were collected,and the ELISA qualitative test and RT-PCR were used to detect the contents of HBV serological markers (HBsAg,anti-HBs,HBeAg,anti-HBe,anti-HBc) and HBV DNA. Results The HBV DNA positive rate was 96.15% in Ⅰ group; the HBV DNA positive rate was 48.08% in Ⅱ group; the HBV DNA positive rate was 4.76% in Ⅲ group. The quantitative HBV DNA in Ⅰ group was significantly higher than that in Ⅱ and Ⅲ groups (P<0.01); the quantitative HBV DNA in Ⅱ group was significantly higher than that in Ⅲ group (P<0.05). The detection coincidence rates of HBV DNA and HBsAg were 73.33% and 72.50%,respectively,and there was no significant difference between them (P>0.05). Conclusion The combination detection of HBV serological markers and HBV DNA quantification plays a complementary role in the diagnosis of HBV infection,and has a more accurate diagnosis as well as can provide a more effective reference.

Serological markers; HBV DNA; Hepatitis B virus; Quantitative determination

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.014

吴洪秋,主管检验师,研究方向：检验医学。E-mail：305370460@qq.com

R512.6+2

A

1006-5709(2016)04-0415-04

2015-08-21