鲁 珍，刘家扬，谌馥佳，李恩中，杨 锟，张建设，郜胜勤（.黄淮学院生物工程系，河南 驻马店 463000；.河南豫坡酒业有限责任公司，河南 西平 463900）



高温大曲中高产糖化酶菌株的筛选鉴定及固态发酵条件优化

鲁 珍1，刘家扬1，谌馥佳1，李恩中1，杨 锟1，张建设2，郜胜勤2
（1.黄淮学院生物工程系，河南 驻马店 463000；
2.河南豫坡酒业有限责任公司，河南 西平 463900）

摘 要：对高温大曲中高产糖化酶菌株进行分离和鉴定，并对筛选得到的菌株进行发酵条件的优化。结果表明：试验前期获得的8株产酱香菌株中GX06菌株产糖化酶能力最强，同等条件下其糖化酶活力为706.13 U/g；通过形态观察及16S rDNA序列同源性分析，初步鉴定该菌株为Bacillus cereus；通过单因素和正交试验确定该菌株的最佳产酶条件为：以尿素为最佳氮源，以麸皮为最佳碳源，初始pH值6.0，接种量9%，在50℃下发酵70 h后，其产物糖化酶活性可达917.03 U/g。

关键词：高温大曲；糖化酶；鉴定；优化

酱香型白酒是在复杂的传统酿造工艺条件下酿制出的具有独特品味风格的白酒种类，在市场上深受高端消费者的青睐。高温大曲作为酱香型白酒酿造中的发酵剂、糖化剂和生香剂，在酿酒时用曲量较大（约85%～95%）[1]，由于传统生产工艺条件复杂，在采取固态发酵生产工艺时产酒率较低。而酱香型白酒产酒率低主要是由高温大曲中微生物发酵产淀粉酶活力不高和糖化发酵不彻底所导致的，因此开展糖化酶发酵特性研究意义重大[2]。研究以试验前期筛选的8株产酱香高温大曲菌株为材料，进一步筛选以期获得高产糖化酶的菌株，再通过单因素和正交试验设计优化固态发酵工艺确定最适产酶条件，旨在为后续的产糖化酶菌种改良以及糖化酶的开发、生产和应用提供依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株 以实验室前期筛选的8株产酱香细菌为供试菌株。

1.1.2发酵原料及试剂 发酵用的麸皮、高粱、黄豆均为市购，其他试剂有尿素、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、NH4NO3、(NH4)2SO4、冰乙酸、乙酸钠、3,5-二硝基水杨酸等，均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器设备 ZWY-240恒温振荡培养箱（上海智城分析仪器有限公司）；LDKM-40KCS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SW-CJ-2FD超净操作台（苏州苏洁净化设备有限公司）；SHP-250FE智能生化培养箱（上海三发科学仪器有限公司）；JB5374-91电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；PHS-3C精密pH计（上海仪电分析仪器有限公司）。

1.1.4培养基 （1）营养琼脂培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH值7.0。（2）种子液培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0。（3）斜面保藏培养基：牛肉膏 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH值7.0。（4）基础固体发酵培养基：碳源 10 g，磷酸二氢钾 0.02 g，硫酸镁 0.02 g，氮源1 g，无菌水10 mL。（5）淀粉琼脂培养基：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2%，可溶性淀粉2%。

1.2试验方法

1.2.1平板透明圈法 将8株产酱香菌株接种到淀粉琼脂培养基中培养12 h，温度设定到50℃。然后滴加碘液于平板上，待显色后测定透明圈直径（D）和菌落直径（d），计算两者比值（HC）[3]。

1.2.2糖化酶菌株形态及生理生化实验和功能菌株的鉴定 （1）形态及生理生化鉴定。形态学鉴定包括细菌平板菌落观察和形态学观察。生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》第8版中芽孢杆菌属特征选择接触酶、淀粉水解、柠檬酸盐利用、V.P、MR、厌氧生长、pH值5.7生长等试验项目。（2）功能菌种鉴定。以细菌16S rDNA扩增时的通用引物27F（5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'）和1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）为上下游引物，采用试剂盒法提取菌体总DNA。PCR扩增时反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30 个循环；72 ℃ 5 min[4]。用胶回收试剂盒纯化PCR 扩增产物，并送至南京金瑞生斯物工程有限公司测序。将最终测序结果在NCBI中进行BLAST比对，用Neighbor-Joining[5]构建高产糖化酶菌株的系统发育树。

1.2.3高产糖化酶菌株糖化酶活力的测定 将固体发酵产物加入pH值4.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，混匀后经滤纸过滤得到粗酶液。采用3,5-二硝基水杨酸法测定糖化酶活力[6]。葡萄糖标准曲线的回归方程为y=0.587 1x-0.018 9，R2=0.991 4。

1.2.4高产糖化酶菌株发酵条件的单因素试验 （1）碳源：在基础固体发酵培养基（以黄豆粉为氮源）的基础上，分别以麸皮、葡萄糖、高粱、可溶性淀粉为碳源，初始pH值为6.0，添加量为10 g，种子液接种量为5%，发酵温度50℃，发酵时间为48 h，发酵结束后测定糖化酶活力。（2）氮源：以麸皮为优势碳源，分别选择硝酸铵、硫酸铵、黄豆粉、蛋白胨、尿素为氮源配制固体发酵培养基进行发酵，添加量为1 g，初始pH值为6.0，种子液接种量为5%，发酵温度50℃，发酵时间为48 h，发酵结束后测定糖化酶活力。（3）初始pH值：以麸皮为优势碳源，以尿素为优势氮源，初始pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，种子液接种量为5%，发酵温度50℃，发酵时间为48 h，发酵结束后测定糖化酶活力。（4）接种量：以碳源为麸皮，氮源为尿素配制培养基，初始pH值6.0，分别接入3%、 5%、7%、9%、11%的种子液，于50℃下发酵48 h，发酵结束后测定糖化酶活力。（5）发酵时间：以碳源为麸皮，氮源为尿素配制培养基，初始pH值6.0，接入9%的种子液，于50℃下，分别发酵12、24、36、48、60、72 h，以菌株产糖化酶活力为评价指标，确定最佳发酵时间。

1.2.5高产糖化酶菌株发酵条件的正交试验 在单因素试验结果的基础上，以麸皮为碳源，以尿素为氮源，以菌株产糖化酶活力为评价指标，研究初始pH值、种子液接种量、发酵时间的最佳搭配，各因素的水平见表1。

表1　正交试验的因素与水平

2　结果与分析

2.1高产糖化酶菌株的筛选结果

由表2可知，8株产酱香菌株中以GX06的透明圈与菌落直径比值最大（8.74）；且糖化酶的活力最高，达到706.13 U/g，分别比其他菌株增加17.5%～69.9%。糖化是将发酵原料中的碳水化合物转化成可发酵性糖的全过程，对产酒率影响较大。糖化后发酵液中还原糖含量的高低直接体现了糖化效果的好坏[7-8]。因此，选择GX06高产糖化酶菌株作为糖化剂，可以提高白酒的出酒率。

表2　高产糖化酶菌株的筛选结果

2.2高产糖化酶菌株GX06的特征

2.2.1形态及生理生化特性 GX06菌株菌落颜色为灰白色，表面褶皱，菌落呈圆形，菌体革兰氏染色后为紫色，可以确定为革兰氏阳性菌，接触酶阳性，能水解淀粉，并能够利用柠檬酸盐，V.P和MR试验都为阳性，能在pH值5.7的环境中生长。初步确定为芽孢杆菌类，至于属种，还需借助分子生物学手段进行鉴定。

2.2.2分子检测鉴定 将GX06菌株测序所得的16S rDNA序列拼接后与GeneBank数据库中的标准菌株进行比对，从中获得与GX06菌株序列相近的种、属序列，通过Mega5软件构建系统发育树，如图1所示，GX06菌株与Bacillus cereus HN相似度为99%，初步鉴定为蜡样芽孢杆菌。

图1　菌株GX06系统发育树

2.3高产糖化酶菌株产酶条件的单因素试验结果

2.3.1氮源对产糖化酶活力的影响 如图2所示，5种氮源中产糖化酶最多的是尿素，其酶活达523.51 U/ g，分别比硝酸铵、蛋白胨、黄豆、硫酸铵的酶活高37.81%，43.50%，48.29%，63.09%，说明尿素能促进GX06菌株发酵产糖化酶，是较适宜的氮源。

图2　不同氮源处理发酵产物糖化酶活力的比较

2.3.2碳源对产糖化酶活力的影响 如图3所示，在这4种碳源中以麸皮发酵产酶能力最高，酶活达478.195 U/g；其次是葡萄糖，酶活仅比麸皮低5%；而可溶性淀粉作碳源时，酶活最低，仅140.72 U/g。同时，麸皮发酵产酶的固体发酵产物褐变颜色最深，因此确定麸皮为GX06菌株发酵的最适碳源。

图3　不同碳源处理发酵产物糖化酶活力的比较

2.3.3起始pH值对产糖化酶活力的影响 如图4所示，当发酵液初始pH值为6.0时，GX06菌株的产酶能力最强，酶活最高达440.03 U/g，显著高于其他处理。因此，确定发酵最适初始pH值为6.0。

图4　不同初始pH值处理发酵产物糖化酶活力的影响

2.3.4接种量对产糖化酶活力的影响 如图5所示，当接种量为9%时，发酵产物酶活达最大值（905.10 U/g）；继续增加接种量，菌体越来越密集，培养基的消耗速度也不断加快，资源和空间相对减少，不利于发酵产酶。因此，GX06菌株发酵时接种量不应超过9%。

图5　不同接种量处理发酵产物糖化酶活力的影响

2.3.5发酵时间对产糖化酶活力的影响 如图6所示，随着发酵时间的延长，GX06菌株的糖化酶活力逐渐增大，当发酵到约60 h时糖化酶活力最高，之后酶活的增加幅度减小，因此，选择约60 h的发酵时间较合适。

图6　不同发酵时间处理发酵产物糖化酶活力的影响

2.4高产糖化酶菌株产酶条件的正交试验结果

由表3可知，3 种因素对糖化酶酶活的影响大小依次为发酵时间（C）＞pH值（A）＞接种量（B）。3个因素中，时间的影响差异显著，接种量和pH的影响不显著。在试验设计范围内，优化得到蜡样芽孢杆菌GX06菌种产糖化酶的最佳条件为A2B2C3，即pH 值为6，接种量9%，发酵时间70 h。按A2B2C3条件进行3次平行试验，测量酶活性平均值为917.03 U/g。

表3　正交试验结果

3　结 论

经过生理生化试验和分子生物学鉴定，具有酱香功能同时产糖化酶能力高的GX06菌株为蜡样芽孢杆菌，刘婧玮[9]等也从高温大曲中筛选出一株酱香功能菌，经验证也为蜡样芽孢杆菌。由正交试验结果可知，影响产糖化酶能力的发酵条件排序依次为发酵时间（C）＞pH值（A）＞接种量（B），在最佳条件即pH 值6.0，接种量9%，发酵时间70 h时，GX06菌株的糖化酶活力达917.03 U/g，预期采用此方法可大大增加出酒率。

利用糖化酶提高白酒的出酒率在很多酒厂已见成效，但也有一定的不足，比如单独使用糖化酶会因为酶的单一导致白酒品质差，口感不好[10]。因此，筛选能同时产生糖化酶和蛋白酶的菌株进行发酵，对提升酱香型白酒的风味效果会更好，能显著增加酒中的特殊香味物质和有益次级代谢产物，提升酱香型白酒的营养保健价值。黄永光等[11]获得了一株高产糖化酶和蛋白酶的功能曲霉，该菌株不仅具有高产糖化酶、蛋白酶和多种风味酶类的特点，还具有促进、调节糖化、发酵和生香进程的作用。赵希玉等[12]从茅台酒中分离得到的6株同时具有蛋白分解能力和糖化分解能力的酱香菌，将其制成强化大曲应用于白酒酿造过程，最终发酵所产酒的品质远远优于未添加强化大曲酿制的白酒。这说明菌种产酶是多样的，糖化酶只是其中一种。因此，该研究还将从多功能方面进一步挖掘GX06菌株的其他特性。

参考文献：

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[2] 张志刚，吴生文，陈 飞. 大曲酶系在白酒生产中的研究现状及发展方向[J]. 中国酿造，2011，226（1）：13-16.

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[4] 曾德勇，方 镒，刘 涛，等. 酱香型高温大曲中高产蛋白酶细菌的分离及鉴定[J]. 酿酒科技，2015，249（3）：27-30.

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[8] 张艳梅，王昌禄，郭坤亮，等. 酶对茅台酒酒糟再利用的影响[J].酿酒科技，2005，（10）：81-82.

[9] 刘婧玮，蒋英丽，沈 毅，等. 高温大曲中一株酱香功能菌的分离鉴定及验证[J]. 酿酒科技，2014，244（10）：19-22.

[10] 王旭亮. 白酒发酵高糖化性能霉菌的筛选及鉴定[J]. 酿酒科技，2012，（9）：22-28.

[11] 黄永光. 酱香型白酒酿造中Aspergillus hennebergii及其分泌酸性蛋白酶的研究[D]. 无锡：江南大学，2014.

[12] 赵希玉，赵 丹，赵 晔. 应用纯种微生物提高大曲酱香酒质量工艺试验[J]. 酿酒，2002，29（3）：36-38.

（责任编辑：成 平）

Filtering and Identifying of High-yield Glucoamylase Strains from High Temperature Daqu and Optimization of Solid State Fermentation Conditions

LU Zhen1，LIU Jia-yang1，CHEN Fu-jia1，LI En-zhong1，YANG Kun1，ZHANG Jian-she2，GAO Sheng-qin2
（1. Biological Engineering Department of Huanghuai University， Zhumadian 463000， PRC； 2.Henan Yupo Co.Ltd.， Xiping 463900， PRC）

Abstract：Isolate and identify high-yield glucoamylase strains from high temperature Daqu and optimize the fermentation conditions of filtered strains. The results showed that, the 8 Jiangxiang-producing strains obtained from early stage of test, the GX06 strain has the strongest ability of producing glucoamylase, activity of glucoamylase is 706.13 U/g under the same conditions; by morphological observation and rDNA 16S sequence homology analysis， the strain was identified as Bacillus cereus； the best enzyme production conditions of the strain were determined by single factor and orthogonal test: using urea as the best nitrogen source, using wheat bran as the best carbon source, initial pH value of 6.0, inoculation amount of 9%, after 70 h fermentation under 50℃, the glucoamylase activity of its production is up to 917.03 U/g.

Key words：high temperature Daqu； glucoamylase； identification； optimization

通讯作者：李恩中

作者简介：鲁 珍（1987-），女，河南驻马店市人，助教，主要从事食品科学研究。

基金项目：国家青年自然科学基金项目（51503074）；2015年河南省重点科技攻关项目（152102210025）

收稿日期：2016-02-21

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.04.001

中图分类号：Q93-3

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2016）04-0001-04