王　景， 张鹤达， 李　建， 赵建华， 吴建中， 唐金海

南京医科大学第四临床医学院，南京　210029



·论著·

Smad1参与调节雌激素在乳腺癌细胞中的促增殖作用

王景， 张鹤达， 李建， 赵建华， 吴建中， 唐金海*

南京医科大学第四临床医学院，南京210029

[摘要]目的： 观察在雌激素促进乳腺癌发生、发展的过程中，Smad1与雌激素的相互作用关系，以及其对乳腺癌细胞增殖、侵袭功能的影响，并探讨其作用机制。方法： 通过Western印迹法以及实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)技术检测雌激素作用与Smad1表达的相关关系；采用小发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)干扰技术下调乳腺癌细胞中Smad1表达，并检测其对雌激素作用的影响。通过Transwell法、免疫组化法(IHC)、细胞计数法等研究Smad1表达情况对乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响。结果： Smad1能够在雌激素刺激下提高其转录和翻译效应，雌激素作用4 h后磷酸化Smad-1(p-Smad1)被激活，并在12 h达到最大值(P<0.001)。乳腺癌肿瘤组织中Smad1的表达强于癌旁组织，且Smad1水平与雌激素受体α(ERα)正相关，而p-Smad1的活化被抑制。应用RNA干扰技术沉默两种乳腺癌细胞中Smad1后，细胞体外增殖速度显著下降(P<0.05)；在体内试验中，肿瘤的生长也受到显著抑制(P<0.05)。结论： 雌激素对乳腺癌细胞的促增殖和迁移作用依赖于Smad1；骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)-Smad1途径在雌激素促乳腺癌发生和发展过程中可能发挥重要的调节作用。

[关键词]Smad1；乳腺癌；雌激素受体

乳腺癌是目前严重危害女性健康与生命的恶性肿瘤之一，其发病率与致死率均呈逐年上升的态势。目前全球每年约有120万名妇女发生乳腺癌，有50万名妇女死于乳腺癌。统计结果显示美国2013年即有23万例女性罹患乳腺癌，在女性新发恶性肿瘤中占30%，成为女性中发病率居首位的恶性肿瘤[1]。诸多研究表明，乳腺组织内较高水平的雌激素表达在乳腺癌的发生发展中起重要作用，临床上也常将雌激素受体作为乳腺癌内分泌治疗的重要靶点。雌激素和雌激素受体已被证明在乳腺、子宫和卵巢等妇科癌症中具有促进肿瘤细胞有丝分裂的作用[2]。这些激素敏感性癌症的病因已经表明，雌激素可刺激引发不受机体监管的恶性细胞增殖，从而干扰正常生理过程，驱动肿瘤形成或恶化[3-4]。

骨形成蛋白(BMP)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族，不仅在胎儿期和胎儿出生后的成长发育起重要作用，而且通过调节细胞分化、增殖、凋亡和迁移维持各组织器官的动态平衡[5-8]。由于BMP在骨形成和骨转换中发挥关键作用，这些分子在骨转移中的作用近年来被深入探讨[9-10]。乳腺癌中主要的骨病变是溶骨导致的骨痛、骨折、脊髓压缩和高钙血症。对BMPs及其在乳腺癌中所发挥作用的关注度日益见增，该方面研究也取得了实质性进展。虽然它的机制尚不清楚，骨形成蛋白在乳腺癌治疗中的潜力已不言而喻。

骨形成蛋白，类似于TGF-β，主要是通过Smad通路来诱导细胞应答[11-12]，虽然它们还可以激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[13-14]。BMP-Smad1通路与胚胎发育和维持组织稳定相关[15]。研究发现，该通路对DNA损伤应答和肿瘤发生起关键作用。当发生基因毒性刺激时，BMP激活的Smad1的丝氨酸239位在细胞核内被ATM(ataxia telangiectasia-mutated gene，共济失调毛细血管扩张突变蛋白酶)磷酸化，破坏了Smad1和蛋白磷酸酶(PPM1A)的相互作用，使得Smad1的激活和上调被增强。进而，Smad1通过和p53相互作用抑制Mdm2(murine double minute2，双微基因)介导的p53泛素化和降解。最终，细胞增殖与生存得到调节[16-19]。因此，对于BMP-Smad1通路在乳腺癌的肿瘤形成过程，特别是在其细胞周期与凋亡中所起作用的研究意义重大。

1材料和方法

1.1患者与样本采集本研究收集的肿瘤组织样本来自于江苏省肿瘤医院自2014年11月20日至2015年3月20日期间行根治性切除术的6例乳腺癌患者。该项目经当地伦理委员会批准，所有患者均已签署相关知情同意书。

1.2细胞培养MEFs(小鼠成纤维细胞)、乳腺癌MCF-7细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞均采用DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培养基，内添加10%胎牛血清，常规培养于在37℃，5%CO2的细胞培养箱。细胞传代比率为1∶3，每周给细胞更换新鲜培养基2～3次。

1.3蛋白质印迹法采用考马斯亮蓝法(Bradford法)检测标本抽提液中总蛋白的浓度，操作步骤参照说明书。抗Smad1抗体[Anti-Smad1(9743)]，Smad5(9517)，p-Smad1/5/8(9511)均购自美国CST公司，β-actin(SC81178)抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.4实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)细胞或组织抽提总RNA，按反转录以及扩增试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书要求进行反应。引物序列：Smad1 S-5′-AAACAGGGCGATGAAG-3′，AS-5′-AGTGAGGAAACGGGTG-3′；GADPH S- 5′-AATCCCATCACCATCTTC-3′，AS- 5′-TCACG-CCACAGTTTCC-3′。实验重复3次。

1.5免疫组化法(immunohistochemistry，IHC)组织切片在二甲苯中脱石蜡，然后在乙醇溶液中水化，透于0.1%的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)中，孵一抗，4℃，温育过夜；室温下，在PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)中洗涤3次后，将载玻片与生物素化的羊抗兔二抗进行反应30 min；使用二氨基联苯胺-四盐酸显色后，将载玻片用苏木精进行复染，并封片。阴性对照组用PBS孵育。

1.6Smad1的敲除siRNA(小干扰RNA，美国Thermo Scientific公司和Santa Cruz公司)被用于Smad1的瞬时敲除；而后又通过反转绿病毒载体测试了利用4种shRNA(37928，31427，32418和30824，Dharmacon公司)稳定敲除后Smad1的表达情况，其中的2种shRNA(37928和30824)效果显著并且被我们用于后续的研究。相关实验重复3次。

1.7MTT法[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]检测细胞增殖实验将1 000～2 000个经过处理的乳腺癌细胞接种于96孔培养皿中，于37℃、5%CO2孵箱中孵育；每天取出一块96孔板加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL/孔，37℃，继续孵育4 h后，弃上清，每孔加入150 mL DMSO(二甲基亚砜)，振荡10 min，使结晶物充分溶解，在490 nm处测定光密度(D)值，根据D值绘制细胞生长曲线，连续检测4 d。

1.8细胞划痕实验细胞以1×105/孔接种于6孔板，常规培养；待细胞80%～90%融合时，弃去培养基，PBS漂洗，用Tip头(一次性吸头)在皿底划一直线，PBS漂洗2次。分别在0、24 h于倒置显微镜下拍摄

1.9乳腺癌裸鼠模型建立乳腺癌细胞株混悬于200 μL PBS溶液中，并接种于6周龄大的雄性裸小鼠(购自上海斯莱克公司)肩胛部皮下，每组6只，接种于每只小鼠的细胞总数保持在5×106。接种4周后，测量肿瘤大小，体积估算公式：V(体积)=0.52×L(长度)×W(宽度)。

1.10统计学处理应用SPSS 19.0软件系统，采用Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1雌激素激活乳腺癌细胞中BMP/Smad1通路在小鼠成纤维细胞系中，雌激素作用4 h后p-Smad1被激活，并在12 h达到最大值，此结果在蛋白质和mRNA水平均可得到验证(图1A、1C)。雌激素能激活小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、乳腺癌MCF7细胞系以及MDA-MB-231细胞系中的BMP-Smad1通路(图1C、1D)。实验结果表明Smad1作为BMP-Smad1中的关键基因，能够在雌激素刺激下提高其转录和翻译效应。

图1　雌激素激活BMP/Smad通路A, B: Western印迹显示p-Smad1/5/8 的表达;C, D: real-time PCR显示Smad1的表达. *P<0.05, **P<0.01

2.2BMP/Smad1通路在乳腺癌组织中被激活，并与雌激素受体表达正相关通过Western印迹技术，在6例乳腺癌患者的组织标本中发现, 肿瘤组织中Smad1的表达强于癌旁组织，且Smad1水平与ERα正相关，而p-Smad1的活化被抑制(图2)，这可能与BMP受体突变有关，这表明BMP-Smad1途径在乳腺癌细胞发生发展的过程起复杂的调节作用。

图2　BMP/Smad1通路在郛腺癌组织中被激活，并且与雌激素受体表达正相关A: p-Smad1/5/8的表达; B: Smad1的表达

2.3雌激素促乳腺癌细胞增殖迁移作用部分依赖于Smad1本研究在Smad1敲除的乳腺癌细胞中发现，雌激素对细胞增殖和迁移的影响会被削弱，提示雌激素对细胞的操控作用部分依赖于高表达的Smad1(图3)。利用乳腺癌MCF-7和MB-231行裸鼠体内成瘤实验，在雌激素作用下，敲除了Smad1的肿瘤体积小于对照组(图4A、4B)。

3讨论

在发达国家，乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，也是其女性中癌症相关致死的首要原因[20]。乳腺癌作为一种临床和生物学上的异质性疾病，可由多个细胞通路的异常调节所诱导，对失调通路的研究有助于解释肿瘤的发生[21-24]。

乳腺组织内较高水平的雌激素表达在乳腺癌的发生发展中起重要作用。研究表明，雌激素可刺激引发不受机体监管的恶性细胞增殖，从而干扰正常生理过程，驱动肿瘤形成或恶化[3-4]。ER-配体复合物直接与特定的DNA序列即雌激素反应元件(ERE)结合，与共促进蛋白或共阻遏蛋白相互作用来调节的雌激素相关基因的转录，调节包括肿瘤发生和进展在内的各种生理和病理过程[25]。

图3　下调Smad1表达后，乳腺癌细胞的增殖能力明显下降A:Western 印迹结果;B:MB-231的增殖情况;C:划痕试验. P<0.05

图4　下调Smad1表达后，利用雌激素治疗荷瘤小鼠的肿瘤生长情况

BMPs属于TGF-β超家族，与TGF-β一样，尽管可以激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，但BMP主要通过Smad通路引发细胞应答[11-12]。在Smad通路中，有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的1型及2型受体和细胞内的Smad蛋白将信号从细胞表面传递入细胞核，并在核中与其相关联的转录因子结合来调节下游基因转录。

本研究发现，雌激素能在小鼠胚胎成纤维细胞和乳腺癌细胞系中激活BMP-Smad1通路。在乳腺癌细胞系中，Smad1表达增强，促进细胞增殖和迁移。在Smad1敲除的乳腺癌细胞中，雌激素对细胞增殖和迁移的影响会被削弱，提示雌激素对细胞的操控作用部分依赖于高表达的Smad1。

Smad1作为BMP-Smad1中的关键基因，能够在雌激素刺激下提高其转录和翻译效应。在小鼠胚胎成纤维细胞中，雌激素作用4 h后p-Smad1被激活，并在12 h达到最大值，此结果在蛋白质和mRNA水平均可得到验证。而在乳腺癌患者的样本中，Smad1表达上调与p-Smad1的活化被抑制，我们认为这可能与BMP受体突变有关，体现了BMP-Smad1途径在乳腺癌细胞发生发展过程中调节作用的复杂性。雌激素调节乳腺癌细胞增殖和迁移的过程除了依赖于Smad1以外，还存在其他通路与其交叉作用。由于BMP本身还可以通过激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[13-14]来影响乳腺癌细胞的生物进程，因此进行更深入的研究来探索两条通路之间的交叉作用靶点，能够更好的阐明雌激素促乳腺癌细胞增殖的作用机制。寻找雌激素促进乳腺癌细胞增殖作用的关键靶点，可为乳腺癌的临床治疗提供药物靶标，因此对雌激素促进乳腺癌细胞增殖具体通路机制的深入研究显得尤为重要。

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[本文编辑]李子卓，贾泽军

Smad1 involves in regulating proliferation effect of estrogen in breast cancer cells

WANG Jing, ZHANG He-da, LI Jian, ZHAO Jian-hua, WU Jian-zhong, TANG Jin-hai*

The Fourth Clinical School of Nanjing Medical University, Nanjing 210009, Jiangsu, China

[Abstract]Objective： To investigate the interaction between Smad1 and estrogen in the promotion of breast cancer, as well as its functional role and underlying mechanism.Methods： The interaction relationship of Smad1 and estrogen was detected by Western blotting and real-time PCR. Smad1 was down-regulated using short hairpin RNA (shRNA) interference technology in breast cancer cells. Using Transwell method, IHC and cell counting method to observe the effect of Smad1 on cell proliferation and invasion.Results： Smad1 could increase transcription and translation of breast cancer cells in the stimulation of estrogen. p-Smad1 was activated after four hour activation of estrogen and then reach maximum at twelve hour later (P<0.001). The expression of Smad1 in cancer tissue was enhanced compared to paratumor tissues and Smad1 level was positively correlated with ERα while p-Smad1 activation was inhibited. In vitro cell proliferation, RNA interference silencing of Smad1 in two breast cancer cells decreased propagation ability significantly (P<0.05); in vivo tests, tumor growth was also significantly inhibited (P<0.05).Conclusions： The study indicates estrogen manipulation in breast cancer cells depending on Smad1. BMP-Smad1 pathway plays complex controlling role in the process of cell occurrence and development.

[Key Words]Smad1; breast cancer; ER

[中图分类号]R 737.9

[文献标志码]A

[作者简介]王景，硕士生. E-mail: 2234964343@qq.com*通信作者(Corresponding author). Tel:025-83283364, E-mail: DOCTJH@163.com

[基金项目]国家高技术研究发展资助项目(“863”项目，2014AA020604)，国家自然科学基金 (81272470)，江苏省科技计划面上项目(201513279). Supported by “863” project(2014AA020604) , National Natural Science Foundation of China (81272470), and Science Project of Jiangsu Province(201513279).

[收稿日期]2016-02-14[接受日期]2016-04-01