刘力豪 蔡琨 王晓敏

【摘要】目的：研究纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物在体外对人乳腺癌细胞MCF-7的生长影响。方法：用不同剂量组对体外培养的MCF-7细胞分别干预12、24、36、48、72h后，用MTT法观察其对MCF-7细胞的生长影响。结果：①纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物作用MCF-7细胞12、24、36h，其浓度5、10、20、40mg/L（除24h 10mg/L外）均表现出对MCF-7细胞稳定的抑制作用，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）；②纯种发酵淡豆豉异黄酮对人乳腺癌MCF-7细胞抑制作用，在一定浓度、作用时间有依赖关系，与大豆异黄酮抑制作用相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论：纯种发酵淡豆豉有明确的抗乳腺癌的作用，其24h IC50为（7.58±1.57）mg/L。

【关键词】纯种发酵；淡豆豉；异黄酮；MTT；MCF-7细胞；乳腺癌

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2016）07-0023-05

Abstract：Objective To observe the inhibiting effect on isoflavones extracts from pure fermented Semen Sojae Praeparatum （SSP） to MCF-7 cells′ reproductive activity in vitro.Methods MCF-7 cells were cultured in vitro and interfered by different concentrations of isoflavones extracts from pure fermented SSP for 12，24，36，72 hours respectively. The inhibition of pure fermented SSP to MCF-7 cells were detected by MTT Method.Results （1）The isoflavones extracts from pure fermented SSP show the inhibition to MCF-7 cells compared with the negative control group，by different concentrations of 5mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L for 12h，24h and 36 h （P<0.05），except 24h 10mg/L. （2） Pure fermented SSP could markedly inhibit proliferation of MCF-7 cell line in a time-dependent and dose-dependent manner. The effects of Pure fermented SSP were no difference compared with those of soy isoflavones（P>0.05）.Conclusion The results proved the inhibition of isoflavones extracts from pure fermented SSP show the best inhibiting effect on the proliferation of MCF-7 cells， 24h IC50（7.58±1.57）mg/L.

Keywords：pure fermented， Semen SojaePraeparatum， isoflavones， MTT， breast cancer

淡豆豉是一味以大豆为原材料经发酵而成的传统中药，始载于《名医别录》，有解表除烦、宣发郁热之功效，适用于感冒、寒热、头痛、烦躁、胸闷及虚烦不眠等症[1]，现已广泛应用于成药之中，如维C银翘片、银翘解毒片等。传统制作淡豆豉的方法见于药典，使用桑叶、青蒿的煎煮液浸泡大豆晾干后，再用桑叶、青蒿覆盖初步发酵，再放入容器发酵近20d后得淡豆豉，其制法繁琐、耗时，缺乏剂量标准，量产需要制作经验，且发酵中易受其他微生物的干扰导致失败、甚至产生毒素，这些都直接影响淡豆豉的品控、量产。本实验前期分离得到高效淡豆豉發酵菌株，量化并优化发酵工序，仅需7d即能高效、安全、稳定获得大量纯种发酵淡豆豉[2-3]。乳腺癌作为女性三大恶性肿瘤之一，严重危害妇女健康。大量流行病学研究发现，亚洲人群经常食用富含植物雌激素的食物，其乳腺癌发病率较欧美人群明显降低，而大豆及其相关制品如豆豉、纳豆等则是植物雌激素的主要膳食来源[4-5]，植物雌激素主要包含异黄酮类如大豆苷元、染料木素、木酚类等。有众多文献指出[6-8]，大豆异黄酮对体外癌细胞有抗肿瘤作用。进一步研究显示大豆异黄酮中游离形式生物活性相对非游离型要高，但仅占大豆总异黄酮的2%～3%。大豆发酵后的淡豆豉总异黄酮量与大豆相当，但游离形式苷元是大豆中的10～40倍[9]。因此，淡豆豉可能具有更加理想的防治乳腺癌作用。

目前国内外学者对中药淡豆豉抗肿瘤功能的研究相对不多，对于纯种发酵淡豆豉对人乳腺癌细胞（MCF-7）的研究更加少见，纯种发酵淡豆豉对MCF-7细胞的生长影响如何则需进一步研究。本研究选用前期分离的高效淡豆豉发酵菌株，并采用前期得出的优化发酵条件发酵得到纯种发酵淡豆豉，通过一定的提取方法获得单位质量活性物质较高的纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物，用高效液相色谱法测定提取物主要有效成分含量，以大豆异黄酮作为阳性药物，使用MTT法检测其对MCF-7癌细胞的生长影响，为进一步扩展纯种发酵淡豆豉的临床应用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人乳腺癌MCF-7细胞株，购于中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 试剂 DMEM-H培养基（HyClone公司）；胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）（Solarbio公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Solarbio公司）；0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶（M&C Gene Technology）；实验所使用其他化学试剂均为分析纯级，购于化学试剂公司。

1.1.3 药物 阳性药物大豆异黄酮购于江莱生物公司（精密级，80%），批号：JL 150208005；纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物由本课题组制备及提取。

1.1.4 仪器 CO2培养箱（Thermo公司USA3131型）；离心机（Thermo公司X1R型）；自动酶标仪（Thermo公司1510型）；倒置显微镜（DSZ2000X型）；全自动高压灭菌锅（TOMY公司SX-700型）；高效液相色谱仪HPLC（Agilent公司1260型）；色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；水浴振荡器；水浴锅；分析天平；烘箱；96孔培养板及T25细胞培养瓶（Corning公司）；移液器（大龙兴创实验仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 纯种发酵淡豆豉的制备 购于市场的干大豆，经筛选、室温清水浸泡（12h）后，使干黄豆充分吸收水分膨胀，晾干，按一定质量分装到大三角烧瓶内，经15min，115℃处理后冷却，在超净台内无菌操作，接种高效淡豆豉发酵菌液（按大豆30g∶菌液10ml比例）充分混匀后，于25℃温箱培养发酵7d，获得纯种发酵淡豆豉。

1.2.2 纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物的制备 将纯种发酵淡豆豉于60℃干燥回收，粉碎，过40目筛，称取粉末200g，用石油醚脱脂，减压干燥得到粉末，取100g加入pH=5缓冲液1000ml（由0.2mol/L柠檬酸钠与0.1mol/L柠檬酸配制成），加入10mg β-葡萄糖苷酶、1000ml乙酸乙酯，45℃、超声60min，减压干燥得异黄酮粗品，按粗品、大孔树脂1∶40比例上AB-8大孔树脂柱乙醇反复洗脱，浓缩、干燥得纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物。

1.2.3 纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物主要成分含量测定 参照文献[10]，使用高效液相色谱（HPLC）法测定提取物异黄酮含量，色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），大豆苷元测定条件：流动相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶55∶1；检测波长：250nm；柱温：30℃；流速1ml/min；进样量：10μl。染料木素测定条件：流动相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶65∶1；检测波长：262nm；柱温：30℃；流速1ml/min；进样量：10μl。精密称取标准品大豆苷元（daidzein，5.25mg）、染料木素（genistein，5.55mg），加80%甲醇溶解，定容至50ml，得0.105 mg/ml 大豆苷元对照品溶液、0.111 mg/ml染料木素标准品溶液。

分别精密称取精密称取纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物0.5g，用10ml含有2mol/L盐酸的80%乙醇溶解大豆苷元样品，用10ml 80%乙醇溶解染料木素样品，均超声15min，4000r/min 离心5min，重复两次，分别合并提取液，水浴蒸干，用80%的乙醇定容至10ml并经0.45μm膜过滤备用。

1.2.4 药物组的配置 精密称取1mg纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物，充分溶解于5ml无水乙醇中，加入20ml DMEM-H（不加FBS）培养液稀释上述液体，得20%乙醇混合液，经0.22μm膜过滤，用DMEM-H（不加FBS）培养液稀释得到浓度为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/L共8个浓度异黄酮提取物溶液，同样方法精密称取1mg大豆异黄酮制备以上8个浓度，全部密封、4℃避光保存备用。

1.2.5 MCF-7细胞的体外培养 将贴壁生长的MCF-7细胞经0.02%EDTA/0.25%胰酶（2∶1）混合液消化脱壁后按一定量接种至DMEM-H培养液（含10%FBS）中吹散均匀，移入新细胞培养瓶，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每3～4d传代1次，每日于倒置显微镜下观察细胞生长状况，及时剔除污染、死亡的细胞，本次实验选用第四代细胞。

1.2.6 MTT实验 实验设对照组、空白组、不同濃度阳性对照组、不同浓度药物组。取对数生长期的MCF-7细胞，倒出培养液，用适量PBS（磷酸盐缓冲液）冲洗培养瓶底壁后吸出丢弃，加入0.02%EDTA/0.25%胰酶1ml，混匀，于37℃消化2～3min，倒置显微镜下观察约80%细胞变圆时加入DMEM-H（含10%FBS）培养液3ml，轻轻反复吹打冲洗培养瓶底壁，经收集离心后用DMEM-H（含10%FBS）培养液调整单细胞悬液浓度为4×104个/ml。以每孔100μl接种96孔板，培养12h使细胞贴壁生长铺满底部，然后给以不同浓度药物组各100μl，对照组加入100μl 20%乙醇（DMEM-H培养液稀释，不含FBS），空白组则加入100μL DMEM-H培养液（含10%FBS），每组设3个平行孔，于37℃、5%CO2孵化箱培养。分别培养12、24、36、48、72h后，取出，每孔加入5mg/ml MTT（由PBS配成5mg/ml浓度） 20μl，继续培养4h后，吸出培养基，每孔加入150μl DMSO，于低速摇床10min，静置20min，于酶标仪测490nm各孔吸光度OD值。

生长抑制率（IR）=（1-药物组OD值/对照组OD值）×100%

公式中药物组为给予不同浓度的药物实验组，对照组为不加药物处理的对照组。

1.3 统计学处理 实验数据以（x±s）表示，采用SPSS 16.0统计软件进行分析，显著性检验用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物含量测定结果 通过HPLC法检测得到两种异黄酮标准品与样品HPLC分离色谱图（图1～4），根据两种标准品的线性范围配制样品溶液浓度，分别精密吸取10μl，注入高效液相色谱仪，每样品3针。用外标法计算并换算纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物中大豆苷元、染料木素的平均含量为（26.06±0.82）mg/g、（54.65±0.74）mg/g，纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物的异黄酮含量约为（8.07±0.09）%。

2.2 纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物对MCF-7细胞的生长影响 纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物作用MCF-7细胞12、24、36h后，其浓度5、10、20、40mg/L（除24h 10mg/L外）均表现出对MCF-7细胞稳定的抑制作用，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。随药物浓度升高，作用时间的延长，其抑制作用逐渐增强。在作用MCF-7细胞48h后，药物组对MCF-7细胞抑制作用出现反复，作用MCF-7细胞72h后抑制率反而整体上升。（图5～6）（表1～2）。

2.3 两种药物对MCF-7细胞生长影响的比较 根据2.2分析结果，采用纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物4个浓度（5、10、20、40mg/L）与同浓度阳性药物大豆异黄酮在不同时段（12、24、36h）对MCF-7细胞抑制率的研究，采用重复测量设计资料的方差分析。实验数据满足Mauchly球形假设（P>0.05），直接采用重复测量方差分析。纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物组与大豆异黄酮组相比较，两者对MCF-7细胞的抑制作用组间之间差异无统计学意义（F= 1.167，P=0.373）。纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物组与对照组相比，两者对MCF-7细胞的抑制作用组间之间差异有统计学意义（F=7.327，P=0.004）。即在上述浓度范围，纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物有与大豆异黄酮类似的作用，对MCF-7细胞增殖有抑制作用（图7）。

3 讨论

乳腺癌的病因目前尚未定论，病因学研究显示可能与遗传、免疫、环境、饮食等因素有关，比较公认且经多年研究证实的，即为乳腺癌为一种雌激素依赖性肿瘤，内源性雌激素水平持续升高或外源性雌激素大量补充，导致雌激素长期暴露都会增加乳腺癌发生的概率[11]。植物雌激素类物质是一类源于植物、活性与雌激素相似的杂环多酚类天然化合物，能与人体内的雌激素受体（ER）结合从而引发雌激素效应，但其结合率、效能远远低于雌激素，但又占据雌激素受体，从而消减了雌激素长期暴露作用，起到预防、治疗乳腺癌的作用。

实验结果表明，纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物中大豆苷元、染料木素的含量达（26.06±0.82）mg/g、（54.65±0.74）mg/g，总异黄酮含量约为（8.07±0.09）% 。与其他类似文献[12-13]所公布的自然发酵淡豆豉提取物异黄酮含量相比，纯种发酵淡豆豉提取物所获得的异黄酮含量远远高于其他，说明纯种发酵法与其他类方法相比，更加优越，值得推广。

在作用MCF-7细胞12、24、36h内，纯种发酵淡豆豉異黄酮提取物在5、10、20、40mg/L浓度对MCF-7细胞表现出显著的抑制作用（P<0.05），且其抑制作用与药物浓度、作用时间呈正相关。淡豆豉异黄酮提取物作用MCF-7细胞24h的IC50为（7.58±1.57）mg/L（表1）。与大豆异黄酮组对MCF-7细胞的抑制作用无明显差异（P>0.05）），表明有效含量约8%的纯种发酵淡豆豉异黄酮提取物与有效含量约80%的大豆异黄酮具有相似的抑制作用，侧面证明纯种发酵淡豆豉所含异黄酮类活性成分较大豆异黄酮高。纯种发酵淡豆豉异黄酮类物质与MCF-7细胞接触后，抑制效果立刻产生，则可能与持续占据ER导致MCF-7细胞增殖能力下降有关。上述结果说明纯种发酵淡豆豉具有明显的抗乳腺癌的作用。

实验中药物干预MCF-7细胞48h、72h后出现各药物组抑制率不再呈类线性关系，而在72h后各组抑制率反而明显抬升，并不能说明此时药物对抑制率产生主导作用。MTT法检细胞抑制率其本质包括了增殖受限细胞和死亡细胞，在96孔板中培养48h、72h的细胞，其生长环境不再适宜、营养成分殆尽、代谢物积累、坏死细胞内容物的释放等都使细胞增殖受限，同时可诱发细胞凋亡，因此数据分析时，不采用48h、72h的数据。

综上所述，纯种发酵淡豆豉具有明确的抗乳腺癌的作用。其对人乳腺癌MCF-7细胞抑制作用与纯种发酵淡豆豉浓度、作用时间呈正相关， 24h的IC50为（7.58±1.57）mg/L。纯种发酵淡豆豉发挥抗乳腺癌作用的机制还需进一步的深入研究。

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（收稿日期：2016.02.02）