黄　娟，刘秀芬，2，余红蕾，王立琼，程首超，程学文，赵红玲**

(1.咸宁市中心医院儿内科，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院)



低分子柑桔果胶粉对哮喘小鼠Th1/Th2平衡及核因子NF-κB表达的影响*

黄娟1，刘秀芬1，2，余红蕾1，王立琼1，程首超1，程学文1，赵红玲1**

(1.咸宁市中心医院儿内科，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院)

摘要：目的 探讨核因子-κB(NF-κB)和Th1/Th2免疫失衡在哮喘小鼠模型中的作用及低分子柑桔果胶粉防治的机制。方法 用卵清白蛋白(OVA)建立哮喘模型。BALB/c小鼠随机分为四组：正常对照组、哮喘组、低分子柑桔果胶治疗组、地塞米松治疗组，每组10只。留取支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞总数计数和分类计数；应用ELISA法检测BALF中IL-4、IFN-γ浓度，采用免疫组化检测NF-κB的表达。结果 低分子柑桔果胶粉治疗组血和BALF中IL-4的含量明显低于哮喘组(P<0.05)； 低分子柑桔果胶粉治疗组哮喘小鼠肺组织中NF-κB阳性细胞百分比显著低于哮喘组(P<0.05)； 哮喘小鼠肺组织中NF-κB表达与BLAF中的IL-4浓度成显著正相关(P<0.05)，而与BLAF中的IFN-γ浓度成显著负相关(P<0.01)。结论 低分子柑桔果胶粉能降低支气管哮喘小鼠血清及BALF中炎症因子IL-4的浓度，减轻支气管哮喘模型小鼠肺组织病理损害,可能的机制是调节Th1/Th2平衡及抑制NF-κB激活,减少气道上皮的NF-κB表达,从而阻止哮喘的发生发展。

关键词：低分子柑桔果胶粉(MCP)；哮喘；NF-κB；IL-4；IFN-γ；Th1/Th2平衡

低分子柑桔果胶(MCP)是从天然产物柑桔中经过特殊技术提取得到的一种以半乳糖为主要成份的多糖。动物实验证实，MCP有直接增强免疫功能的作用，可纠正炎症中Th1/Th2 失衡，调节CD4+/ CD8+细胞的比例，增强单核细胞细胞毒作用及巨噬细胞的吞噬功能[1]。国外已经广泛用于肿瘤的研究和治疗[2]，但国内外尚无其用于哮喘治疗的研究报道。本文将探讨MCP粉对哮喘小鼠Th1/Th2失衡及核转录因子NF-κB的调节作用。

1材料与方法

1.1小鼠哮喘模型的建立及剂量设计SPF级BALB/c雄性小鼠40只(由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供)，体重14～18g，随机分为正常对照组(A组)，哮喘组(B组)，低分子柑桔果胶治疗组(C组)，地塞米松治疗组(D组),每组10只。采用V级OVA制备模型，哮喘模型的制作参照文献[3]的方法略作改进，分致敏、激发两个阶段，方法如下：于第8d和第21d腹腔注射0.1ml含1%OVA的Al(OH)3凝胶致敏，各一次，共2次，第32d开始使用空气压缩雾化器向置于密闭有机玻璃容器内的小鼠喷雾1%OVA，每天吸入30min，连续定时激发1周。C组于激发前每天8:30按2400mg/kg灌胃低分子柑桔果胶。D组于每次激发前1h按0.5mg/kg腹腔注射地塞米松液。A组以生理盐水代替OVA致敏和激发。根据实验用品说明，成人服用MCP粉的剂量为80mg/(kg·d)，因动物实验的最高剂量为人类剂量的30倍，所以设计MCP剂量为2400mg/(kg·d)。

1.2实验方法各组末次激发24h内处死，眼球动脉取血，收集血清，肺组织进行支气管肺泡灌洗并留取支气管肺泡灌洗液(BALF)经2000rpm离心15min，取上清液检测IFN-γ和IL-4浓度。支气管肺泡灌洗小鼠收取BALF，细胞分类计数使用瑞士染色。BALF沉渣用1mlPBS液重悬，取200μl滴于玻片上自然晾干备用，余用枪头抽取100μl至细胞计数板，用低倍镜计数四角的四大方格中白细胞总数。按下式计算小鼠细胞总数：白细胞数/L=(四大方格内白细胞总数*107)/4。BALF沉渣涂片待自然晾干后，加瑞氏液2～4滴，固定0.5～1min，再加等量缓冲液与染料混匀，染色5～10min，用自来水冲去染液。选择涂片体尾交界处染色良好区域，在高倍镜下，按一定顺序移动视野，根据形态特征对200个白细胞，按嗜酸性粒细胞(EOS)、淋巴细胞(Lym)、巨噬细胞(Mφ)、以及中性粒细胞(Neu)作细胞分类计数，所有计数均由一个研究者完成，采用单盲法。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定BALF中IFN-γ、IL-4浓度，免疫组化SP法测肺组织中NF-κB活化值，测定方法按试剂说明书进行操作。

2结果

2.1HE染色观察B组小鼠肺组织切片HE染色可见肺内支气管粘膜下、肺内支气管及血管周围较多炎性细胞浸润，以EOS、Lym、Neu为主，粘膜下水肿，粘液腺增生，气道上皮多处断裂和上皮细胞的脱落，肺间质和支气管腔内可见炎性细胞渗出和分泌物，支气管壁略显增厚和基底膜轻度增厚且不规则，细支气管平滑肌轻度肥大。C组和D组小鼠肺组织炎性细胞浸润等病理改变较B组明显减轻。见图1(封二)。

2.2PAS染色观察A组小鼠肺组织切片PAS染色未见黏液分泌；B组PAS染色可见气道上皮杯状细胞增生肥大，大量黏液形成黏液栓；C组和D组肺组织PAS染色与B组相比杯状细胞增生不明显，黏液分泌明显减少。见图2(封二)。

2.3电镜观察A组小鼠显示正常肺泡Ⅱ型上皮细胞，支气管纤毛上皮细胞纤毛排列齐整，肺泡隔结构正常，表面微绒毛丰富；未见淋巴细胞及嗜酸性粒细胞附壁及浸润；肺细小动脉内膜、中膜、外膜清晰，内皮细胞扁平，平滑肌细胞之间有散在的胶原纤维，见图3(A)。B组小鼠电镜观察显示肺间质有EOS浸润，肺泡Ⅱ型上皮细胞水肿，核轻度固缩，胞浆部分内质网扩张，表面微绒毛部分脱落，线粒体轻度肿胀。支气管纤毛上皮细胞纤毛排列稀疏，有断裂、融合现象；肺泡腔及血管壁有多个巨噬细胞浸润,见图3(B)。C组程度较B组有所减轻，D组可见肺泡Ⅱ型细胞结构接近正常，炎症细胞明显减少，见图3(C、D)。

图3　小鼠肺组织电镜图(×10000)

A组正常肺泡隔结构。B组显示内皮细胞受损，线粒体空泡形成(黑色箭头所示)。C组和D组细胞结构较B组完整，炎症细胞减少

2.4各组小鼠BALF中细胞计数与分类计数的比较结果显示B组BALF中细胞总数、EOS百分比均显著高于A组(P<0.01)，C组BALF中细胞总数、EOS百分比低于B组(P<0.01或P<0.05)，但仍显著高于A组(P<0.01)。见表1。

表1　各组小鼠BALF中细胞总数和分类计数±s)

与A组比较，*P<0.01；与B组比较，#P<0.05、##P<0.01

注：实验中因技术原因标本不合格，故小鼠数量与原来每组数量不同(下同)

2.5各组小鼠BALF中IL-4和IFN-γ浓度的变化根据系列稀释500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml、7.8pg/ml、0pg/ml的标准品获得的OD值，绘制浓度一光密度标准曲线，以此标准曲线为标准，将待测标本在自动酶标仪测得的OD值转换成IL-4浓度值和IFN-γ浓度值。BALF中IL-4浓度B组明显高于A组、D组(P<0.01)。IFN-γ浓度B组显著低于A组(P<0.01)，C组比B组高，但无显著差别(P>0.05)。见表2。

表2　各组小鼠血清、BALF中IL-4浓度的变化

与A组比较，*P<0.05、**P<0.01；与B组比较，#P<0.05、##P<0.01

2.6各组小鼠血清中IL-4浓度变化和肺组织NF-κB活化的比较根据系列稀释500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml、7.8pg/ml、0pg/ml的标准品获得的OD值，绘制浓度一光密度标准曲线，以此标准曲线为标准，将待测血清在自动酶标仪测得的OD值转换成IL-4浓度值。血清中IL-4浓度B组高于A组(P<0.01)，C组血清中IL-4浓度明显比B组低(P<0.01)。但是D组与B组比较差异无显著性(P>0.05)。NF-κB主要表达于支气管上皮细胞胞浆及核内，支气管上皮细胞胞核、间质炎性细胞核可见棕黄色颗粒，为NF-κB免疫阳性蛋白，以核阳性染色的细胞比例作为NF-κB的活化值。B组NF-κB核阳性染色细胞最多，明显多于A组(P<0.01)其余三组呈不同程度的升高，介于A组和B组之间(P<0.05或P<0.01)。相关性分析显示小鼠肺组织中NF-κB的表达与血清中IL-4浓度(r=0.806,P<0.01)成正相关。见表3。

表3　各组小鼠血清中IL-4浓度变化及肺组织NF-κB活化的比较±s)

与A组比较，*P<0.05、**P<0.01；与B组比较，#P<0.05、##P<0.01

3讨论

既往的研究证明众所周知，Th1/Th2的免疫失衡及其功能紊乱在哮喘的发病机制中起着十分重要的作用，哮喘患者均存在Th1/Th2失衡。免疫学上一般将IFN-γ和IL-4分别作为Th1和Th2细胞的特征性细胞因子。通过检测这两个细胞因子可以反映出Th1/Th2的极化状态，判断其失衡程度。而通过纠正Th亚群的失衡来实现对哮喘的治疗，是治疗哮喘有效的途径。

MCP基本分子结构是半乳糖醛酸，以α-1，4糖苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸酶。分子量在一万到二万之间，由于其分子量小，无抗原性，无毒性，水溶性好，容易被胃肠道吸收而进入血液系统发挥作用，对机体的特异性和非特异性免疫产生影响。MCP具有双向免疫调节作用，其中主要包括: 激活巨噬细胞、增强巨噬细胞的吞噬功能自然杀伤细胞(NK)，调节和增加单核细胞毒作用，刺激产生相关的细胞因子，活化B淋巴细胞和T淋巴细胞，增强其作用，激活补体系统，调节红细胞免疫，影响蛋白质的合成及抗体的生成，影响机体免疫信息：如调节炎症中Th1/Th2失衡，调节CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，调节cAMP和cGMP浓度和相对比值，参与调节神经-内分泌-免疫(NM)网络，打破机体免疫系统损伤造成的免疫耐受，提高免疫系统对抗原的识别能力等。动物实验证实，低分子柑桔果胶通过阻断脂多糖信号通路抑制内毒素诱导的前炎症反应[4]。McCarty等[5]研究表明MCP富含半乳糖单体，与Galectin-3有极强的亲和性，通过结合肿瘤细胞表面丰富的Galectin-3，使得肿瘤的生长直接受到抑制，另一方面肿瘤生长的营养源也被切断，因而抑制肿瘤的生长与转移。目前国外已用于肿瘤领域的临床治疗。而在糖尿病、高血脂、铅中毒等方面的防治也正成为研究的热点[6]。是否MCP能用于哮喘的防治，目前国内外尚没有报道。本实验建立急性哮喘小鼠模型，以MCP作为干预药物，初步探讨其对哮喘气道炎症的调节作用及可能机制。

本实验结果表明C组肺组织支气管及血管周围炎症细胞浸润明显减少，BALF液涂片EOS%较B组明显下降，血清和BALF液中IL-4浓度降低，提示其有一定程度的抗炎及调整Th1/Th2的作用。MCP可能是通过增强免疫功能来纠正Th1/Th2失衡。但C组效果不及D组，提示其可作为有效的免疫调节剂辅佐糖皮质激素用于哮喘的治疗，以期更好地控制哮喘，减少激素用量。C组NF-κB蛋白的表达较B组明显降低，提示MCP有抑制NF-κB信号通路的作用，这也可能是其改善气道炎症、调节Th1/Th2失衡的又一分子机制。通过本实验研究表明，MCP对气道炎症有一定的调节作用，其可能机制为： 通过抑制前炎症因子的表达，进而抑制NF-κB信号通路的活化； 直接抑制NF-κB蛋白，阻断NF-κB通路的信号传递。

MCP的应用剂量是根据临床用于调节免疫功能的剂量转换而来。因此，MCP合理的剂量范围尚有待进一步研究确定。通过对本研究中量效关系的分析发现，MCP降低哮喘小鼠气道炎症，调节Th1/Th2失衡，阻断NF-κB通路的信号传递。这些发现提示MCP可作为一种新的有免疫调节剂用于哮喘的治疗，这将为支气管哮喘的药物和饮食治疗开辟一条新的途径。

参考文献：

[1]Salman H,Bergman M,Djaldetti M,et al.Citrus pectin affects cytokine production by human peripheral blood mononuclear cells[J].Biomed Pharmacother，2008，62(9):579

[2]Zhang W，Xu P，Zhang H.Pectin in Cancer Therapy：A Review[J].Trends Food Sci Tech，2015，44(2)，258

[3]李昌崇，张维溪，陈小芳，等.巨嗜细胞炎性蛋白1α及其mRNA在哮喘小鼠气道炎症中的作用[J].中华儿科杂志，2004，42(2):90

[4]Chen CH，Sheu MT，Chen TF，et al.Suppression of endotoxin-induced proinflammatory responses by citrus pectin through blocking LPS signaling pathways[J].Biochemical Pharmacology，2006，72(8):1001

[5]McCarty MF，Block KI.Toward a core nutraceutical program for cancer management[J].Integrative Cancer Therapies，2006，5(2):150

[6]邬晓婧，张爱珍，陈建国，等.低分子柑桔果胶粉对糖尿病小鼠血糖、血脂的调节作用[J].中国全科医学，2006，9(20)：1685

Effect of Modified Citrus Pectin on the Expression of Nuclear Factor NF-Kappa B and Th1/Th2 Balance in Mice of Asthma

HUANG Juan,LIU Xiu-fen,ZHAO Hong-ling,et al

(XianningCentralHospital,XianningHubei437100，China)

ABSTRACT：Objective To discuss the role of nuclear factor kappa-B and Th1/Th2 immune imbalance in the model mice of asthma and the mechanism of low molecular citrus fruit powder. Methods BALB/c mice were randomly divided into four groups:the control group，asthma group ，MCP treated group and DXM treated group.In the experiment，the mouse model of asthma was established by the ovalbumin( OVA) challenge methods.The cell numbers and differentiated cell numbers in BALF were counted by different counting fluids；Application of ELISA methods to detect concentration IL-4，IFN-γ in BALF；The protein expression of NF-κB were detected by Immuno-histochemistry(IHC).Results Compared with asthma group，The level of IL-4 in serum and BALF of MCP treated group had a markedly decrease(P<0.05)；The protein expresstion of NF-κB in MCP treated group were significantly decrease than asthma group；There was a positive correlation between NF-κB in lung and IL-4 in BALF(P﹤0.05)，A negative correlation between the level of IFN-γin BALF(P<0.01).Conclusion Low molecular citrus fruit powder can reduce the inflammatory cytokines of IL-4，relieve lung tissue pathology damage in the mice mode of asthma.The mechanisms may be regulate Th1/Th2 balance and restrain the nf-kappa B activation，reduce airway epithelium nf-kappa B expression，so as to prevent the occurrence of asthma.

KEY WORDS：Modified Citrus Pectin；Asthma;NF-κB;IL-4;IFN-γ;Th1/Th2 balance

(收稿日期：2016-02-04)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.0102

中图分类号：R-332

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2016)02-0102-04

基金项目：湖北科技学院校级科研项目(zx1314)

**通讯作者：E-mail:308138353@qq.com