张初梅，刘　莉，侯冬枝*，胡　晟，桂茹艺，黄　燚，平其能

(1.广东药学院药科学院，广州　510006；2.中国药科大学药学院药剂教研室，南京210009)



镶嵌蒙脱石微球处方前研究及其制备

张初梅1，刘莉1，侯冬枝1*，胡晟1，桂茹艺1，黄燚1，平其能2

(1.广东药学院药科学院，广州510006；2.中国药科大学药学院药剂教研室，南京210009)

摘要：目的对盐酸倍他洛尔(betaxolol hydrochloride，BH)进行处方前研究，并以丙烯酸树脂为膜材制备载药蒙脱石/丙烯酸树脂微球。方法采用UV和HPLC法考察药物BH的稳定性、表观溶解度、pKa值、亲水亲油平衡值以及pH值对BH 离体角膜透过性的影响；以丙烯酸树脂RS和RL为骨架材料，O1/O2乳化-溶剂挥发法制备蒙脱石载药缓释微球，扫描电镜观察其形态表征，为处方优化提供依据。结果 BH稳定性良好，在各种溶液中的溶解度为16.30～42.27 mg·mL-1。BH为弱碱性药物，pKa值为7.75，角膜透过性受pH值影响，碱性条件下有利于BH的角膜透过。O1/O2乳化-溶剂挥发法制备的微球外形圆整，无粘连情况，表面略有粗糙感。结论处方前研究建立的UV-VIS分析方法准确可靠。O1/O2乳化-溶剂挥发法可用于制备镶嵌蒙脱石离子交换给药系统。

关键词：盐酸倍他洛尔；角膜透过性；蒙脱石；微球

盐酸倍他洛尔(betaxolol hydrochloride，BH)是一种选择性β1受体阻滞剂，具有钙离子拮抗作用，可通过减少房水的生成起到降眼压的作用。BH眼用剂型贝特舒，临床主要用于治疗开角型青光眼和高眼压症。蒙脱石是天然硅酸盐矿石膨润土的主要成分，具有良好的膨胀性、吸附性、阳离子交换性及较大的内、外比表面积。通过离子交换和吸附作用可以包载许多药物分子，产生缓释作用[1-4]。以丙烯酸树脂为膜材[5-6]制备载有药物的蒙脱石缓控释微球，增加其缓释效果，减小毒性和不良反应，适应眼用制剂要求。本实验对BH做处方前的研究，同时考察药物离体角膜透过性，为制剂的处方设计和工艺优化提供基础依据；并采用O1/O2溶剂挥发法制备蒙脱石载药微球[7-8]。

1仪器与试药

1.1仪器UV754N紫外分光光度计，pHS-25型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；RCT安全型磁力搅拌器(德国IKA公司)；XW-80A涡旋机(上海泸西分析仪器厂有限公司)；SHA-B恒温震荡器(常州博远实验分析仪器厂)；BL-220H电子天平(日本岛津公司)；LD4-2A低速离心机(金坛市宏华仪器厂)；E103G光学显微镜(德国Classica公司)；S-3400N电子扫描显微镜(日本HITACHI公司)。

1.2试药盐酸倍他洛尔原料药(济南浩化实业有限公司)；丙烯酸树脂(eudragitRS，RL，德国Degussa公司)；医用蒙脱石(浙江三鼎科技有限公司)；其他试剂均为色谱纯或分析纯。

1.3实验动物新西兰兔，体质量2 300～2 800 g，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证编号：4407207133，在洁净环境下代为饲养。

2方法与结果

2.1测定BH特征吸收峰分别用水、1 mol·L-1的氯化钠溶液、盐酸溶液和磷酸盐缓冲液(pH 7.4)溶液配制成一定质量浓度的BH溶液，过滤后，在200～500 nm处扫描，得到盐酸倍他洛尔的特征吸收波长为274.5 nm。

2.2制作标准曲线分别精密称取10 mg BH原料药8份，置于10 mL量瓶中，分别用水、人工泪液、0.5 mol·L-1的氯化钠溶液、1.0 mol·L-1的氯化钠溶液、2.0 mol·L-1的氯化钠溶液、0.5 mol·L-1的氯化钾溶液、0.5 mol·L-1的盐酸溶液、磷酸盐缓冲液(pH 7.4)定容至刻度，得到1 mg·mL-1的标准母液。

精密吸取0.2，0.4，0.8，1.2和1.6 mL的标准母液，置于10 mL量瓶中，用相应溶剂稀释至刻度，得到质量浓度为0.02，0.04，0.08，0.12和0.16 mg·mL-1的一系列标准溶液。用溶剂作为空白溶液，在274.5 nm波长处用紫外分光光度计测定吸光度，建立不同溶剂中BH的标准曲线。见表1。

表1不同溶剂中BH的线性关系

Tab.1 The linear relationship of BH in different solvents

溶剂拟合方程r值水A=5.0418C-0.02170.9993人工泪液A=4.8732C-0.00480.99980.5mol·L-1氯化钠溶液A=4.8154C+0.01060.99931.0mol·L-1氯化钠溶液A=4.7673C-0.00160.99962.0mol·L-1氯化钠溶液A=4.8173C+0.00980.99980.5mol·L-1氯化钾溶液A=4.7173C+0.00840.99960.5mol·L-1盐酸溶液A=4.8115C+0.00310.9998磷酸盐缓冲液(pH7.4)A=4.8124C+0.01270.9995

2.3精密度分别在1 d内的不同时间测定0.04，0.10和0.16 mg·mL-1BH水溶液的吸光度5次，考察日内精密度。连续5 d测定上述样品的吸光度，每天1次，考察日间精密度。测得日内吸光度RSD值分别为0.69%，0.34%和0.21%；平均相对标准偏差为0.38%，日间吸光度RSD值分别为0.49%，0.47%和0.21%。平均相对标准偏差为0.58%，两者RSD值均小于1%，说明紫外法测量BH的精密度符合要求。

2.4稳定性按照2.2项下方法制备质量浓度为1 mg·mL-1的BH标准母液，精密吸取1.0 mL标准母液，置于10 mL量瓶中，用相应溶剂稀释至刻度，得到0.10 mg·mL-1的BH标准溶液，在34 ℃恒温中振荡，每1 h取样1次，测定BH含量，连续测定12 h，按照2.2项下标准曲线计算质量浓度，考察BH在各类溶剂中的稳定性。

测定结果显示，BH在水、人工泪液、0.5 mol·L-1的氯化钠溶液、1.0 mol·L-1的氯化钠溶液、2.0 mol·L-1的氯化钠溶液0.5 mol·L-1的氯化钾溶液、0.5 mol·L-1的盐酸溶液、磷酸盐缓冲液(pH 7.4)溶液中的质量浓度RSD值分别为0.41%，0.93%，0.78%,0.54%，0.73%,0.65%，0.85%和1.21%，说明在不同离子溶剂中12 h内BH稳定性良好。

2.5BH表观溶解度的测定在一定体积溶剂中加入过量的BH，涡旋5～10 min，置于34±1 ℃恒温水浴中振荡，每隔0.5 h取样，过滤，取澄清液20 μL稀释，测定吸光度，按照2.2项下标准曲线计算质量浓度，当相邻2次时间点样品质量浓度相等时(或<5 %)，可判断溶解达到平衡，此时质量浓度视为平衡溶解度，平行3次，计算平均值，即为BH的表观溶解度。见表2。

表2BH溶液的表观溶解度

Tab.2 The solubility of BH in different solutions

(34±1 ℃)

2.6表观油水分配系数配制1 mg·mL-1的BH，水/ 磷酸盐缓冲液/林格溶液(GBR)为水相，蒸馏水/磷酸盐缓冲液/ GBR饱和24 h的正辛醇为油相，在50 mL的具塞三角瓶中，加入水相5 mL、油相5 mL。油水相混合后在34±1 ℃恒温水浴中以150 r·min-1搅拌72 h,以 3 000 r·min-1离心10 min，取水层过滤并稀释数倍，在274.5 nm处测定吸光度，按照2.2项下方法带入相应溶剂的标准曲线，计算含量，记为C1。

(1-1)

其中C0为混合前水相BH质量浓度。

表3BH在不同溶剂中的表观油水分配系数

Tab.3ThelgPofBHindifferentsolutions

(34±1 ℃)

2.7BH角膜透过性研究

2.7.1实验装置本实验使用改良的Franz扩散池研究角膜透过性，它由供给池和接收池组成，供给池容量0.5 mL，接收池容量为5 mL，扩散表面为模拟眼球的曲面设计，有效扩散面积为0.7 cm2。见图1。

图1立体角膜透过装置

Fig.1The diagram of corneal permeation

2.7.2扩散介质GBR溶液即谷胱甘肽-碳酸氢钠林格溶液，可作为角膜的营养液，角膜上皮细胞在其中具有良好的活性[9]，本实验选择GBR溶液作为扩散介质。GBR溶液由两部分组成：

A液：称取12.4 g氯化钠、0.716 g氯化钾、0.206 g磷酸二氢钠、4.908 g碳酸氢钠溶于1 000 mL水中；

B液：称取0.23 g 氯化钙、0.318 g氯化镁、1.80 g葡萄糖 、0.148 g谷胱甘肽(氧化型)溶于1 000 mL水中；

A液和B液分开，低温保存，使用前将两者等量混合。

2.7.3离体角膜的制备用耳缘静脉注射空气法处死兔子，在死后20 min内取出眼球，除去眼球表面的血渍和筋膜，用眼科剪和镊子小心分离角膜，除去虹膜、晶状体和玻璃体等角膜下组织，从眼球上剪下带2～4 mm巩膜环的角膜片，用生理盐水清洗后将角膜放入新鲜配制的GBR溶液中备用(注意：整个过程中避免弄伤角膜)。

2.7.4离体角膜透过性实验将角膜在GBR溶液中润洗后，固定在Franz扩散池的供给池和接收池之间，角膜的上皮细胞与供给池接触，接收池(含搅拌子)注入5 mL的GBR溶液作为扩散介质，温度为34±1 ℃[10]，搅拌速度为200 r·min-1。供给池加入0.5 mL 的样品溶液，在30，60，90，120，180，240 和360 min从接收池取样0.5 mL，并补充等体积的扩散介质。

空白角膜透过液的制备：按照上述方法，在供给池中放入0.5 mL的GBR溶液，其他处理方法不变，在360 min时取透过液，过滤，进样测定，即为空白角膜透过液。

2.7.5数据处理

2.7.5.1角膜透过性

(1-2)

其中Cn为t时间药物的测量质量浓度，Ci为t时间前药物的测量质量浓度，V0为接受池中扩散介质的体积，V为取样体积。

(1-3)

以单位面积的累计透过量Q-时间t做线性拟合，结果见表4。由表4可知，在pH值为6.34～8.24的透过环境中，药物累积透过量与时间呈良好的线性关系(r的原子量依次为0.999 2，0.998 7，0.998 3和0.999 1)。

2.7.5.2角膜水化值(HL%)

角膜水化值是体外评价眼用制剂对角膜刺激性的重要指标，通常角膜水化值为76%～80%，超过83%的水化值即判定角膜受到一定程度的损伤[11]。将新取角膜或体外实验暴露于扩散介质的角膜区域(透过实验后，将角膜边缘用于固定的巩膜环剪掉)称质量，记为Wb，90 ℃干燥12 h后，再次称质量，记为Wa。

(1-4)

由表4可知，角膜水化值HL%均小于83%，说明角膜均未受损伤，角膜透过的数值是可信的。但角膜水化值随着pH值的增大也略有升高，这说明pH值过高(大于8.24)会对离体角膜造成一定损伤，这对于调整制剂的pH值具有参考意义。

表4不同pH条件下BH在兔离体角膜的透过性

Tab.4 Permeation of BH through isolated cornea of rabbits at different pH

pH拟合方程rHL/%6.34Q=0.0023t-0.05780.999278.9%±0.6%7.04Q=0.0028t-0.01950.998780.7%±1.2%7.74Q=0.0034t-0.00890.998381.3%±0.8%8.24Q=0.0043t+0.03980.999182.1%±0.9%

2.8载药蒙脱石微球的制备本实验采用O1/O2溶剂乳液-溶剂挥发法制备微球[7-8]。实验步骤：精密称取MMT-BH 50 mg、BH 30 mg、EURS和EURL共400 mg，加入增塑剂TEC 20%，50 mg 吐温-80，再加入5 mL乙腈进行溶解，作为内相O1；精密量取20 mL的轻质液体石蜡和200 mg的Span-80作为外相O2，用磁力搅拌器搅拌均匀。将O1逐滴滴加到O2中，搅拌速度为800 r·min-1，超声使其乳化均匀，乳化10 min后，将转速调为300 r·min-1，挥发溶剂3 h，当溶液呈澄清状态时离心，最后用正己烷洗涤微球，除去微球表面的液体石蜡，得到具有一定外观形态和流动性的微球，晾干。微球在电子扫描显微镜下的结果见图2。由图2可见，微球外形圆整，无粘连情况，表面略有粗糙感。该工艺制备的微球的平均载药量为14.31%，平均包封率为94.35%，且实验结果稳定，RSD值小于1%，具有可重复性。

图2SEM MMT-BH微球图片

Fig.2 Scanning electron micrographs of MMT-BH microspheres

3讨论

盐酸倍他洛尔用于治疗高眼压或青光眼，可通过减少房水的生成起到降眼压的作用，并可增加眼血流量，且无明显心血管及肺的不良反应。作者对盐酸倍他洛尔进行了一系列分析，首先采用紫外分光光度法扫描了盐酸倍他洛尔的特征吸收波长,为274.5 nm，建立了盐酸倍他洛尔在不同离子溶剂中的标准曲线。对BH的稳定性考察结果表明，在不同离子溶剂中，12 h内BH稳定性良好。BH在各类扩散介质包括水、GBR溶液、人工泪液、磷酸盐缓冲液中的溶解性较好(16.30～42.27 mg·mL-1)，测定结果表明，BH易溶于水和盐溶液，为水溶性药物。其中扩散介质碱性越大，BH的溶解性越小。在水、GBR溶液、人工泪液和磷酸盐缓冲液中的表观油水分配系数的测定显示，BH为亲水性化合物(lgP< 0)，且pH值越小，亲水性越大。计算BH的pKa值为7.74，为弱碱性药物，解释了pH值对BH理化性质的影响。离体角膜透过性实验的结果表明，BH的角膜透过性受pH值的影响，药物在碱性条件下更易透过角膜，但pH值过高(大于8.24)会对离体角膜造成一定损伤，因此对调整制剂的pH值具有参考意义。制备的微球在扫描电镜下可见微球外形圆整，无粘连情况，表面略有粗糙感，表明采用油包油溶剂挥发法制备微球是可行的。

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The preformulation study and preparation of montmorillonite-intercalate microspheres

ZHANG Chumei1，LIU Li1，HOU Dongzhi1*，HU Sheng1，GUI Ruyi1，HUANG Yi1， PING Qineng2

(1. College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2. College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Abstract:ObjectiveTo research the physical and chemical properties of betaxolol hydrochloride (BH) preformulation. The Eudragit RS/RL 100 was applied as membrane materials in the preparation of drug-loaded montmorillonite microspheres. MethodsThe model drug BH was determined by UV and HPLC, investigating the stability, apparent solubility, pKa value, hydrophilic lipophilic balance (HLB) of BH and the effect of pH on the in vitro corneal permeability . The drug-loaded montmorillonite microspheres were prepared by O1/O2 emulsion-solvent evaporation technology, and the morphology of microspheres was characterized by scanning electron micrographs for the prescription optimization. ResultsThe BH had excellent stability. The solubility of BH in various solution was among 16.30-42.27 mg·mL-1. The BH was a weak alkaline molecule with a pKa of 7.75. The pH had a significant influence in the drug corneal permeability, an alkaline conditions would be beneficial to the BH through cornea. The MMT-BH microspheres were prepared by O1/O2 emulsion-solvent evaporation technology, and the SEM results showed a spherical and slightly rough surface. Conclusion The UV method to determine the content of betaxolol hydrochloride was accurate and reliable.The O1/O2 emulsification-solvent evaporation method could be used for the preparation of montmorillonite exchange microspheres.

Key words:betaxolol hydrochloride；corneal permeability；montmorillonite；microspheres

(收稿日期：2015-11-30)

中图分类号：R944

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)03-0281-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.018

*通信作者：侯冬枝，女，副教授，硕士研究生导师

第一作者简介：共同张初梅，女，在读本科生；

基金项目：国家自然科学基金项目 (编号：51102052);2015年省级大学生创新创业训练计划项目

刘莉，女，硕士研究生