吕国天　王爽　王庆坤

321000 东阳，东阳市广福医院神经内科(吕国天，王庆坤)；310009 杭州，浙江大学第二附属医院神经内科(王爽)



微小RNA-146a rs2910164及微小RNA-499 rs3746444与缺血性脑卒中的关系

吕国天王爽王庆坤

321000 东阳，东阳市广福医院神经内科(吕国天，王庆坤)；310009 杭州，浙江大学第二附属医院神经内科(王爽)

【摘要】目的探讨微小RNA(miR)-146a rs2910164和miR-499 rs3746444单核苷酸多态性与缺血性脑卒中的关系。方法采用基因直接测序技术及Taqman-PCR基因分型技术检测378例缺血性脑卒中患者(病例组)及378名健康人(对照组)miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444位点的等位基因和基因型的频率分布，采用条件Logistic回归分析其与缺血性脑卒中的关系。结果病例组的miR-146a rs2910164位点等位基因G频率分布高于对照组(P=0.003, OR=1.412, 95%CI=1.121～1.716)，基因型GG及CG+GG 的频率分布也高于对照组(GG：P=0.002, OR=2.080, 95%CI=1.330～3.250；CG+GG：P=0.011, OR=1.488, 95%CI=1.110～2.012)。2组miR-499 rs3746444位点的等位基因与基因型频率分布比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。 结论miR-146a rs2910164单核苷酸多态性可能与缺血性脑卒中相关，miR-499 rs3746444则可能与缺血性脑卒中无关。

【关键词】微小RNA-146a；微小RNA-499；单核苷酸多态性；缺血性脑卒中

缺血性脑卒中是由遗传因素和环境因素共同作用所致的一种多基因遗传性复杂疾病，此病发病过程与多基因之间和基因与环境之间的相互作用等有关，与此病相关的基因在其发病过程中发挥单一或联合作用，它们还可与环境因子共同作用增加此病的发病风险[1]。吸烟、饮酒、高脂饮食、高血压病、糖尿病等已被证实是此病重要的致病因素[2]。除此之外，大量研究显示，遗传因素如相关基因的突变、缺失、遗传多态性都与缺血性脑卒中的发病相关[3]。研究表明微小RNA(miR)-146a与miR-499参与血管损伤应答过程，可调控血管循环系统中血栓形成或炎症信号通路中的重要基因的表达，其变异可引起靶基因的功能异常[4-5]。我们推断其单核苷酸多态性可能是影响缺血性脑卒中的风险因子，故对缺血性脑卒中患者与正常人miR-146a rs2910164及miR-499 rs3746444位点的等位基因及基因型频率分布情况进行了分析，以初步探讨其遗传多态性与缺血性脑卒中发病的关系。

对象与方法

一、研究对象

将2012年1月至2014年12月在东阳广福医院急诊科和神经内科就诊并经临床和影像学检查(CT或MRI)确诊的378例缺血性脑卒中患者设为病例组，并将同期在该院体检的年龄、性别与之相互匹配的378名健康人设为对照组。病例组符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》中缺血性脑卒中的诊断标准[6]。对照组排除了新发或既往脑血管病史，且无家族遗传病史。本研究获我院医学伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

二、方法

用EDTA抗凝2组的外周血样。采用基因直接测序技术及Taqman-PCR基因分型技术检测2组miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444位点等位基因及基因型的频率分布。

1.DNA提取

采用人类基因组DNA提取试剂盒(北京世纪康为公司)提取各研究对象200 μl EDTA抗凝外周血的人类基因组DNA, 并采用Eppendorf紫外分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度，将A260/A280检测结果为1.8～2.1的样本放置于-80℃低温冰箱保存备用。

2.Taqman-PCR

采用Taqman-PCR基因分型技术对miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444进行基因分型，其中rs2910164位点上游引物为5’-GAACTGAATTCCATGGGTTGTGT-3’，下游引物为5’-GCCCACGATGACAGAGATATCC-3’，探针FAM-5’-TCAGACCTGTGAAATT-3’，探针VIC-5’-TCAGACCTCTGAAA-TT-3’；rs3746444位点上游引物为5’-GCTGTTAAGACTTGCAGTGATGTTT-3’，下游引物为R-5’-CGGGAAGCAGCACAGACTT-3’，探针FAM-5’-CCA-CGTGAACGTCACAG-3’，探针VIC-5’-CCACGTGA-ACATCACAG -3’。Taqman-PCR扩增体系总体积为5 μl, 其含有100 ng的基因组DNA模板，2.5 μl的2×TaqMan PCR MasterMix和2.5 μl的20×SNP Assay (包含上下游引物和FAM/VIC 探针)。其反应条件为95℃预变性10 min, 92℃变性15 s, 60℃退火和延伸1 min，上述过程持续40个循环[4]。为验证Taqman-PCR技术基因分型结果的准确性，本研究采用DNA直接测序技术随机筛选2组10%的样本进行检测分析[4]。

三、统计学处理

计算2组miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444位点的等位基因及基因型频率，并采用哈代-温伯格遗传平衡定律分析抽样基因型的群体代表性，其中P>0.05时认为抽样具有群体代表性[7]。采用SPSS 17.0软件包处理数据，用配对t检验分析计量资料，配对χ2检验分析计数资料，并采用条件Logistic回归计算OR。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、病例组与对照组的一般资料

病例组与对照组高血压病、糖尿病和肥胖症百分率的比较差异均具有的统计学意义，且病例组的血脂高于对照组，P均<0.05，见表1。

二、病例组与对照组miR-146a rs2910164与miR-499 rs3736444位点等位基因和基因型频率分布

DNA直接测序与Taqman-PCR共同分析miR-146a rs2910164与miR-499 rs3736444位点的检测结果完全一致。miR-146a rs2910164位点的等位基因G在病例组的频率分布明显高于对照组，此位点病例组中的基因型GG 、CG+GG 基因型频率分布也显著高于对照组(P均<0.05)。miR-499 rs3736444位点的等位基因A、G及基因型AA、AG、GG和AG+GG在2组中的频率分布比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表2。 miR-146a rs2910164与miR-499 rs3736444位点在对照组中的频率分布均符合哈代-温伯格遗传平衡定律(miR-146a rs2910164:χ2=3.085,P=0.079; miR-499 rs3736444:χ2=0.245,P=0.621)。

讨论

miR是一类长度为21～23个核苷酸的非编码RNA分子，其不仅在组织器官的生长和发育、细胞增殖和分化中发挥重要作用，而且在多种复杂疾病中发挥重要调控作用[8-10]。此类RNA小分子在人类基因组中所占比例较低，但其可调控人类大约三分之一的基因。miR基因或其前体分子的遗传变异可能影响miR分子的成熟或与靶基因结合的能力，引发靶基因调控功能紊乱[11]。大量研究也证实miR的单核苷酸多态性与复杂疾病的发生和进展相关[9-10,12-13]。缺血性脑卒中也是一类由遗传因素和环境因素相互作用诱发的复杂疾病, miR-146a和miR-499也参与缺血性脑卒中相关作用基因的表达调控[4], 而rs2910164和rs3746444分别位于上述两前体分子序列中，此两多态性位点可能影响miR-146a和miR-499分子的表达或结构异常。因此，上述两位点可能与缺血性脑卒中存在相关性。

表1

病例组与对照组的一般资料

表2

miR-146a rs2910164与miR-499 rs3736444位点基因型和等位基因在病例组和对照组中的频率分布

注：此结果调整了糖尿病、高血压病、肥胖症和血脂状态

在本研究中我们发现，病例组中高血压病、糖尿病和肥胖症所占百分率明显高于对照组，而甘油三酯、胆固醇、LDL和HDL水平与对照组比较差异均有统计学意义，提示糖尿病、高血压病、肥胖症和血脂代谢异常可能是缺血性脑卒中疾病的风险因子。进一步分析等位基因和基因型频率分布的结果显示，miR-499 rs3746444位点G等位基因、AG、GG和AG+GG基因型与缺血性脑卒中均无统计学相关性，提示此位点可能未参与此病的发生过程，此位点等位基因和基因型均不能作为评估缺血性脑卒中发病的遗传风险因子。而病例组rs2910164位点的G等位基因、GG和CG+GG基因型频率明显高于对照组，说明此位点与缺血性脑卒中有关，提示miR-146可能参与缺血性脑卒中的发病过程，等位基因G和携带有等位基因G的基因型GG、CG+GG可能是缺血性脑卒中的遗传风险因子。本研究结果与Huang等[14]和Zhu等[15]的报道基本一致，而与Liu等[16]的有关296例缺血性脑卒中患者和391名健康对照者的研究结果不同，造成各研究结果不同的可能原因与样本量小或纳入人群的地域、遗传背景、环境等因素差异有关。rs2910164位点位于前体miR-146分子序列中，其C等位基因与G等位基因的转换，可引发其成熟miR分子的表达差异，已有研究报道，相对于不携带此位点G等位基因的个体，携带此位点G等位基因的个体中miR-146的表达水平更低[17]。而高水平的miR-146可以抑制与缺血性脑卒中发病相关的促炎NF-κB和MAP激酶信号通路的激活和TNF-α的表达[18-19]。因此携带此位点G等位基因的个体表达较低的miR-146分子，而低水平的miR-146未能有效抑制和调控上述与缺血性脑卒中相关的促炎通路的激活和调节细胞因子的表达，提高了缺血性脑卒中的发病风险。

综上所述，本研究结果显示，miR-499 rs3746444位点与缺血性脑卒中可能无关，但miR-146a rs2910164等位基因G及基因型GG和CG+GG可能与缺血性脑卒中有关，可能是缺血性脑卒中的遗传风险易感因子。

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Association of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 polymorphisms with risk of ischemic stroke

LyuGuotian,WangShuang,WangQingkun.

DepartmentofNeurology,GuangfuHospitalofDongyangCity,Dongyang321000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the association of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 single nucleotide polymorphisms and ischemic stroke. MethodsTaqman-PCR and DNA sequencing assays were performed to investigate the genotype and allele gene of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 loci in 378 patients with ischemic stroke (ischemic stroke group) and 378 healthy individuals (control group). The association of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 single nucleotide polymorphisms with the risk of ischemic stroke was assessed by logistic regression analysis. ResultsIn the ischemic stroke group, the frequency of allele G (P=0.003, OR=1.412, 95%CI=1.121-1.716), genotype GG (P=0.002, OR=2.080, 95%CI=1.330-3.250), CG+GG (P=0.011, OR=1.488, 95%CI=1.110-2.012) of miR-146a rs2910164 was significantly higher compared with those in the control group. However, the frequency of allele gene and genotype of miR-499 rs3746444 did not significantly differ between the ischemic stroke and control groups (both P>0.05). ConclusionsThe single nucleotide polymorphism of miR-146a rs2910164 rather than miR-499 rs3746444 is probably correlated with the risk of ischemic stroke.

【Key words】miRNA-146a; miRNA-499; Single nucleotide polymorphism;Ischemic stroke

(收稿日期：2015-11-19)(本文编辑：洪悦民)

Corresponding author, Lyu Guotian,E-mail:monkeydygf@sina.com

通讯作者，吕国天，E-mail：monkeydygf@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.012

·临床研究论著·