关瑜 孙卫华

摘 要：目的：研究生物反应器培养人二倍体MRC-5细胞，并用来制备水痘疫苗的可行性。方法： 将MRC-5细胞接种1L生物反应器，使用GE公司Cytodex 1 微载体，浓度为：3g/L，工作体积300ml，待细胞长满单层后接种水痘病毒，当细胞病变约达75%以上时结束培养，收获细胞培养物及培养液，-80℃快速冻融一次，过滤除去微载体及细胞碎片，收获病毒悬液，测定水痘病毒滴度。结果： 细胞接种反应器后，大约3小时贴壁完成，5小时后开始伸展为长梭形，3天后细胞长成致密单层，接种水痘病毒后大约48小时病变，72小时收获。收获后的病毒滴度检测结果为120，000 PFU/mL。结论 ：二倍体细胞可以在生物反应器中正常生长，并且接种水痘病毒后产生病变，本试验证明了应用生物反应器动态培养二倍体细胞扩增水痘病毒，生产水痘疫苗的方法可行。

关键词：水痘；疫苗；生物反应器

中图分类号： Q-3.2 文献标识码： A 文章编号： 1673-1069（2016）15-195-2

0 引言

目前针对水痘和带状疱疹还没有有效的治疗方法，接种疫苗是预防水痘感染的唯一有效手段[1-2]。国外生产水痘疫苗采用细胞工厂工艺进行疫苗制造[3-4]，而国内生产水痘疫苗仍然采用传统的克氏瓶或转瓶工艺进行疫苗生产[5-6]。转瓶培养具有劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，瓶间差异较难控制等缺点，越来越不适应GMP和WHO认证的要求。生物反应器培养技术在国外已有四十多年的应用历史，近十年来在中国开始逐渐普及[7]。由于其便捷安全的操作方式，可控性好，占用较少的空间等优点，生物反应器已被越来越多的国内疫苗生产企业所接受，如辽宁成大、广州诺成等生物科技有限公司生产的冻干人用狂犬病疫苗和乙脑疫苗[8-9]，另外国内有些公司也逐渐开始研究微载体反应器替代转瓶或细胞工厂工艺生产甲肝疫苗、麻疹疫苗等产品[10]。本课题将生物反应器工艺引入水痘疫苗的生产中研究其可行性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株及毒株

MRC-5细胞株来源：购买于ATCC；工作代细胞批号为：WCB20100901，代次为24代。

水痘毒株Oka株来源：购买于ATCC；工作代毒种批号为：20120201 W，代次为47代。

1.2 主要耗材

175cm2细胞培养瓶（CORNING）；细胞工厂（CORNING）；多道移液器、单道移液器（规格：20～200ul；100～1000 ul，Eppendorf）；玻璃刻度吸管（规格：5mL，10mL等）； 6孔细胞培养板（CORNING）；Cytodex 1 微载体（GE公司）。

1.3 主要设备

荷兰Applikon生物反应器；天津泰特仪器设备有限公司 电热恒温水浴箱；Thermo生物安全柜；三洋37℃ CO2恒温培养箱；OLYMPUS CKX41倒置显微镜。

1.4 微载体培养方法

将MRC-5细胞接种1L生物反应器，待细胞长满单层后接种水痘病毒，具体步骤如下：

复苏24代MRC-5细胞，至T175细胞瓶中，按1：2比例传代3次至8瓶，镜下观察细胞形态为成纤维细胞形态，呈梭形，细胞排列致密无空隙，准备用于生物反应器培养。

反应器用二甲基二氯硅烷硅化处理，微载体经PBS溶胀并清洗处理后加入反应器中，高压湿热灭菌反应器及微载体，准备培养细胞。（微载体使用量3g/L ，培养体积300mL，按培养面积比1：2上罐传代）

用0.25%胰酶消化8瓶长满单层T175细胞后，加入预热的细胞生长液吹打均匀，接种至1L反应器中，使用体积为300mL。将1L反应器控制设定温度：37℃；pH值：7.2；溶氧值：40%；调整适当搅拌速度，以微载体混匀且不沉淀的最小搅拌速度为最佳。每天换液300mL，同时取样观察细胞生长状态。待微载体表面的细胞长满均一单层时接种水痘病毒，设定温度：35℃；pH值：7.3；溶氧值：35%；观察细胞病变情况，待细胞病变约达75%以上时结束培养，收获细胞培养物及培养液，-80℃快速冻融一次，过滤除去微载体及细胞碎片，收获病毒悬液，测定水痘原液病毒滴度。

1.5 检验方法

测定病毒滴度是用蚀斑试验的方法，取人二倍体细胞MRC-5，以pH7.2、含10%小牛血清的MEM细胞培养基接种6孔板，每孔加密度为1×105个/mL的MRC-5细胞悬液3mL，置37℃ 5% CO2培养箱培养3～4天，待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，弃去原有的生长液。用含3%小牛血清、5%蔗糖和1%谷氨酸钠的PBS缓冲液将待检品做10倍系列稀释，一般取10-2～10-5稀释度的样品接种6孔板，每稀释度接种2孔，置37℃、5% CO2培养箱吸附60分钟，期间每20分钟轻轻振摇一次。吸附完毕补加pH 7.4、含3%小牛血清的MEM培养基维持液，3m1/孔，置37℃ 5% CO2培养箱培养7天。培养到期后，弃去原生长液，每孔加1～2mL 0.25%的考马斯亮蓝染液，染色5～10分钟，弃去考马斯亮蓝染色液，将六孔板用PBS冲洗干净，在阅片灯灯光背景下点数空斑个数，计算病毒滴度，计算方法如下：

空斑个数×稀释倍数×10= PFU/mL，即为待检样品的滴度。

2 结果

在显微镜下观察到细胞接种反应器后，细胞悬液中游离细胞逐渐减少，大约3小时贴壁完成。5小时后开始伸展为长梭形，每天换液300ml，大约3天后细胞长成致密单层，接种水痘病毒后大约48小时发现病变，72小时病变达到75%，收获水痘病毒原液。

2.1 细胞接种反应器后的生长状况

2.2 收获液病毒滴度

收获后的水痘原液病毒滴度检测结果为120，000 PFU/mL。

3 讨论

人二倍体细胞作为病毒培养基质细胞，最重要的优点是安全性强，无内外源病毒因子感染，而且已证明无致癌性，但二倍体细胞在转瓶培养条件下难以生产获得高滴度的病毒，因此如何使用人二倍体细胞获得高滴度水痘疫苗，成为近年来的研究重点。而生物反应器条件下培养不但可以增加细胞的密度与数量，且可通过主动通气加强气体交换，稳定的控制温度溶氧pH等参数，创造利于细胞生长和病毒繁殖的环境，易获得高滴度的病毒原液，生产高品质疫苗原液。

通过本试验发现二倍体细胞在反应器中长势良好，接种病毒后产生正常病变，且滴度较高，本试验初步证明反应器动态培养二倍体细胞，扩增水痘病毒，生产水痘疫苗的方法可行。该方法的工艺参数及疫苗产量还有待进一步深入的进行研究。

参 考 文 献

[1] （美）普洛特金（Plotkin，S.），著.疫苗学[M].人民卫生出版社，2011.999-1049.

[2] 张延龄，张晖主编.疫苗学[M].科学出版社，2004.

[3] 刘晔，李生军，李春明.冻干水痘减毒活疫苗转瓶生产工艺的建立[J].微生物学免疫学进展，2014，32（1）：9-12.

[4] 王斐，单雪峰等.水痘减毒活疫苗生产工艺研究[J].中国新药杂志疫苗专刊，2012，10：1174-1177.

[5] 王佃亮，韩梅胜.动物细胞培养用生物反应器及相关技术[J].中国生物工程杂志，2013，23：23-27.

[6] 王树君，代长海等.用为载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液[J].中国生物制品学杂志.2004（06）：45-47.

[7] 查力，高军等.生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志，2006，19（3）：288-290.

[8] 刘景晔，刘令九，屈翠波，王拥军，孙妹，吴晓娟，梁晓莉，王玮，王鹏富.采用一批细胞基质同时收获甲肝和麻疹病毒[J].中国生物制品学杂志，2002（04）.