曹园园　李青山

摘要：目的 探讨表柔比星（Epirubicin）及联合5-氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂（L-OHP）对人肝癌细胞株HepG2的凋亡的影响。方法 应用MTT法观察上述药物单药应用、两药及三药同时或序贯联合应用对细胞HepG2生长的影响，评价药物联合应用的效果。结果 单药应用、两药联合及三药联合应用均对HepG2细胞有显著的抑制作用（P<0.05）；两药联合应用均优于各自单药的抑制效果，5-FU联合L-OHP弱于5-FU或L-OHP与表柔比星联合的抑制效果（P<0.05），由L-OHP到5-FU小剂量序贯联合具有明显的协同作用；三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合（P<0.05），由表柔比星+L-OHP到表柔比星+5-FU的序贯联合应用与三药同步联合应用无显著性差异（P>0.05），但由表柔比星+5-FU到表柔比星+L-OHP序贯应用时明显低于三药同步应用的效果（P<0.05），且三药全量及半量联合应用效果差异无显著性（P>0.05）。结论 表柔比星+L-OHP序贯到+5-FU的联合应用具有高效协同抑制人肝癌细胞株HepG2的作用。

关键词：表柔比星；奥沙利铂；氟尿嘧啶；细胞株HepG2

1 资料与方法

1.1细胞 细胞株HepG2 上海美轩生物。将细胞株置于10%胎牛血清RPMI1640（美国GIBCO）培养液（内含0.1%青霉素、链霉素），并于培养箱37℃、5%二氧化碳内培养。

1.2药物 表柔比星：浙江海正药业；5-氟尿嘧啶：上海旭东海普；奥沙利铂：江苏恒瑞。

1.3用MTT法检测药物对细胞的促凋亡作用 将对数生长期制成细胞悬液，浓度为2×105个/mL，并置于96孔板内培养，每孔200ul，加人药物20ul。并分组：空白组、对照组和药物实验组，5-FU为9.375ug/ml、18.75ug/ml、37.5ug/ml、75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml、600ug/ml；L-OHP为0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5

mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml、8.0mg/ml表柔比星为2.5ug/ml。根据SPSS17.0回归分析IC30，药物浓度为药物的IC30，有研究证实以抑制率大于30%为最佳敏感界值。

1.4药物联合作用 筛选出5-FU的IC30为84.0ug/ml，L-OHP的IC30为86.4ug/ml。采用5-FU的终浓度为84.0ug/ml（全量）和42.0ug/ml（半量）L-OHP的终浓度为86.4ug/ml（全量）和43.2ug/ml（半量）。药物实验组又分为：①单药组5-FU（全量84.0ug/ml和半量42.0ug/ml）、L-OHP（全量86.4ug/ml和半量43.2ug/ml）、表柔比星（2.5ug/ml）；②两药联合组，包括两药同步化疗（5-FU+LOHP、5-FU+表柔比星、L-OHP+表柔比星）和两药序贯化疗（5-FU84.0ug/ml→L-OHP86.4ug/ml、5-FU42.0ug/ml→LOHP43.2ug/ml、L-OHP 86.4ug/ml→5-FU 84.0ug/ml、L-OHP43.2ug/ml→5-FU42.0ug/ml）；③三药联合组，包括三药同步化疗（5-FU 84.0ug/ml+L-OHP86.4ug/ml+表柔比星、5-FU42.0ug/ml+L-OHP43.2ug/ml+表柔比星）和三药序贯化疗（表柔比星+5-FU84.0ug/ml→表柔比星+L-OHP86.4ug/ml、表柔比星+L-OHP86.4ug/ml→表柔比星+5-FU84.0ug/ml、表柔比星+5-FU42.0ug/ml→表柔比星+L-OHP43.2ug/ml、表柔比星+ L-OHP43.2ug/ml→表柔比星+5-FU 42.0ug/ml）。每一个组都设计为四个复孔。单药组直接加入各浓度药物100ul；两药同步联合时采用1：1方案，将药物浓缩一倍，后各加50ul。这样每一孔内的药物浓度、体积和总量未发生改变；三药同步联合时，应用1：1：1方案，先将药物浓缩2倍，再各加25ul，同样为保证药物浓度和总量不变，之后应补加25ul的培养基。序贯化疗时，细胞株按着序贯方案中的顺序先接受前一种药物持续作用24h，之后小心弃除含药培养液， 加入含后一种化疗药物的培养液，并持续作用24h，期间保持培养液总量不发生变化。置于培养箱（37℃、5% CO2）培养48h后，离心弃上清，加入200ul不含血清的培养液及20ul 5mg/mlMTT，继续培养4h，之后再弃去培养液，加人200ul DMSO，并振荡5min后用自动酶标读数仪测OD值，进行药物作用效应计算。

抑制率 =[（对照组吸光值（A）-实验组吸光值（A））÷对照组吸光值（A）]×100%。

1.5两药联合疗效评价 采用fractional productconcept（fp值）[3]来评价两药相互作用的性质，fp值：I1+2/（I1+I2-I1*I2），其中I1+2：两药联合作用平均抑制率，I1和I2：两药单独作用平均抑制率； fp值>1，两药作用性质为协同；fp值=1，两药作用性质为相加；fp值<1，两药作用性质为拮抗。

1.6统计学方法 用SPSS17.0统计软件处理，结果资料采用方差分析和t检验。

2 结果

2.1 5-FU、L-OHP对肝癌细胞HepG2的抑制作用 通过测定稀释至不同梯度浓度的5-FU和L-OHP对细胞株HepG2生长的抑制作用，得出两种药物对HepG2的IC50值约为228.940ug/ml、2737.328ug/ml。

2.2表柔表星、5-FU及L-OHP不同方式的联合用药对肝癌细胞HepG2的抑制作用。

2.2.1单药对肝癌细胞株HepG2的作用 表柔比星、5-FU及L-OHP单独作用时，均能显著的抑制肝癌细胞HepG2的生长（P<0.01）；且5-FU、L-OHP全量作用时抑制作用明显优于半量药物的作用（P<0.05）。见表1。

2.2.2两种药物以不同序贯联合顺序应用时对HepG2的生长抑制作用 各组药物都可以有效抑制肝癌细胞HepG2（P<0.01），其中两药联合优于单药（P<0.01），且全量效果优于半量（P>0.05）；5-FU+表柔比星组对细胞株HepG2的抑制作用优于5-FU+L-OHP组（P<0.05）。两药同步时，5-FU+表柔比星表现了较好的协同作用，而L-OHP+表柔比星组则显示出拮抗作用。5-FU与L-OHP同步化疗时，各组均有显著的抑制作用（P<0.01），但不同联合组之间的抑制作用无统计学差异（P>0.05），5-FU联合表柔比星的作用效果优于5-Fu联合L-OHP（P<0.05）。关于不同剂量和顺序的5-Fu及L-OHP的序贯化疗，半量L-OHP→半量5-FU两药的序贯联合具有协同作用，其余序贯联合均表现为拮抗。见表2。

2.2.3 5-FU、L-OHP及表柔比星三药联合应用 三种药物共同作用于肝癌细胞HepG2时，能明显的降低其生存率（P<0.001），且较所有其他组合效果更优；三药联合时，不同剂量的药物作用的细胞抑制率无统计学差异（P>0.05）；在三药不同序贯联合时，表柔比星+L-OHP→表柔比星+5-FU与同步联合比较无显著性差异（P>0.05），且均显著高于表柔比星+5-FU→表柔比星+L-OHP序贯组（P<0.05）。见表3。

3 讨论

肝癌的发病率在全世界范围内不断升高，运用多种治疗手段综合治疗是肝癌目前的主要治疗原则。化疗在晚期肝癌治疗中占据重要地位，但由于肝癌细胞对化疗药物不敏感及耐药的问题，使得肝癌的化疗效果不理想。目前，经研究证实较为有效的药物有多柔比星类、5-FU类、铂类。其中多柔比星在肝癌的治疗中效果最优，有研究证实表柔比星与其效果相近，它们均属于抗生素类抗肿瘤药。奥沙利铂属新合成的3代铂类药物，与5-Fu有协同作用，以两种药物为主的FOLFOX4化疗方案已于2011年被我国原发性肝癌诊疗规范推荐用于肝癌的姑息治疗中。将以上三种药物应用于本实验中，通过观察它们不同联合及序贯应用时的最大抑制率，以筛选出最优的联合方案，为临床治疗提供一定的实验依据。

本实验中我们探讨了不同剂量的5-氟尿嘧啶、奥沙利铂分别与表柔比星组成的不同的联合或序贯方案对细胞抑制率的影响，从中可以看到含表柔比星组的两药联合方案的抑制作用显著高于不含表柔比星组，表明与含表柔比星的联合方案相比，5-氟尿嘧啶联合奥沙利铂并未显示明显的优势。另外在三药联合应用时对细胞的抑制率达到最高，表明三药联合相对于单药、两药而言为效果最优的化疗方案。并且表柔比星同步奥沙利铂到表柔比星同步氟尿嘧啶时的序贯联合与三药同步联合时比较差异无统计学意义，表明此种序贯不仅没有降低疗效，而且同样可以达到三药同步时的药效，为临床寻找最优的序贯方案提供一定的实验依据。另外当存在药物剂量（全量、半量）不同时，其结果比较差异亦无统计学意义，表明全量应用与半量应用的疗效相当，所以在保证疗效不变的前提下，可以降低剂量，从而降低药物的毒副作用，使其能更好的应用于临床。

由上述得出，表柔比星+L-OHP到表柔比星+5-FU的序贯联合应用具有高效协同抑制人肝癌细胞株HepG2 的作用， 可以作为临床应用的实验依据，并为肝癌患者的化疗及小剂量序贯化疗提供参考。但本实验为体外干预实验，其结果有待于进一步的临床验证。

参考文献：

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[2]刘家贺.于全成 奥沙利铂联合表柔比星经导管肝动脉化疗栓塞介入治疗原发性肝癌临床分析[J].现代医药卫生， 2014，30（05）：743-744.

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编辑/哈涛