何智强

本实验通过向微胶囊制备过程中添加保护剂脱脂乳粉和海藻糖，以乳酸菌的存活率为考察指标，研究保护剂对乳酸菌微胶囊冷冻干燥情况下的影响情况。首先考察了不同浓度的单一保护剂对微胶囊冷冻干燥后乳酸菌存活率的影响，然后通过正交试验找出了最佳的保护剂配比，以及能提高乳酸菌在冷冻干燥下的存活率。

实验方法

乳酸菌的活化。将实验室保藏的乳酸菌冻干粉接人到11%脱脂乳中的水溶液中，经37℃厌氧恒温培养24h，脱脂乳凝固。用无菌水稀释0.1mL凝乳，制得含乳酸菌菌悬液。对菌悬液进行平板划线分离，37℃厌氧培养24h，这样连续传代2-3次，使其充分活化。

复凝聚法制备乳酸菌微胶囊方法。（1）原胶液的制备：取明胶，用蒸馏水适量浸泡溶胀后，加热溶解；取阿拉伯胶水中加热至80℃左右，轻轻搅拌使溶解；两溶液均40℃保温备用。（2）微囊的制备：在40℃水浴条件下，明胶溶液、乳酸菌菌悬液和适量的乳化剂（吐温-80）混合，轻轻搅拌均匀。5min后向混合液加入阿拉伯胶溶液，继续搅拌使明胶和阿拉伯胶溶液充分混合均匀，此时溶液形成稳定的水包油乳液。不断搅拌下，滴加1%醋酸溶液于混合液中，调节pH至3.8～4.0。（3）微囊的固化：在不断搅拌下，溶液自然冷却至30℃左右时，将其置于冰浴中，继续搅拌至温度为10℃以下，加入固化剂，继续搅拌15min，再用10%NaOH溶液调其pH8～9，继续搅拌20min，观察至析出为止，静置待微囊沉降。（4）微胶囊的收集：将固化后的微胶囊用蒸馏水进行洗涤，过筛（320目），收集。

复凝聚法制备乳酸菌微胶囊的最佳工艺条件。菌胶比例1：6，复合胶体浓度15%，凝聚pH值3.8，搅拌速度600rpm，反应时间15min，反应温度30℃。在此工艺条件下所制备微胶囊对乳酸菌的包埋率为92.5%以上，且制备得到微胶囊呈球形好，粘连性低，粒径分布均匀。

乳酸菌菌落总数的测定。（1）以无菌操作将经过充分摇匀的菌液25mL放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1：10的均匀稀释液。（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。（3）另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。（4）选择2～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀釋液于事先灭菌装有MRS固体培养基的平皿内。（5）同时将1mL灭菌生理盐水于事先灭菌装有MRS固体培养基的平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。（6）翻转平板，置37±1℃恒温培养箱内培养48±3h取出，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。根据该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。涂布均匀，每个稀释度作三个平皿。

乳酸菌的存活率。存活率=冻干后微胶囊里活菌数/冻干前微胶囊里的总活菌数×100%。冻干前后微胶囊里活菌数测定：精确称取冻干前后的微囊各50mg，置于100mL灭过菌的PBS缓冲液中破碎，于37℃恒温振荡24小时后，冷却至室温，过滤，取清液进行菌落计数

结果与分析

保护剂对乳酸菌微胶囊冷冻干燥的影响研究。

实验分两部分：单因素实验和正交试验。

脱脂乳粉浓度对微胶囊冷冻干燥的影响。将脱脂乳粉（0g/L，20g/L，40g/L，60g/L，80g/L）分别加入混合乳液中，制备乳酸菌微胶囊冻干品，以冷冻干燥后的乳酸菌的存活率作为考察指标，研究不同浓度的脱脂乳粉对微胶囊乳酸菌存活率的影响。

对脱脂乳粉的实验组实验数据进行单因素方差分析可知，乳酸菌微胶囊在冷冻干燥后的活菌数远高于对照组（加入脱脂乳粉为0的实验组）（P<0.05），这说明，加入脱脂乳粉对乳酸菌微胶囊冻干保护效果明显。当脱脂乳粉浓度≤80g/L时，随着脱脂乳粉浓度的不断增加，冷冻干燥后的乳酸菌的存活率也随之增加。其原因可能是：随着脱脂乳粉浓度的增加，脱脂乳粉对细胞膜的稳定性也断增加，从而减少了冷冻干燥对乳酸菌的损伤；脱脂乳份浓度增加使得冷冻干燥过程中的多孔结构增加，使脱水更快；其提供的蛋白质和乳糖成分不断增加，也提高了乳酸菌的存活率。当脱脂乳粉的浓度≥80g/L时，乳酸菌微胶囊在冷冻干燥后的活菌存活率却略微下降。其可能原因是：当脱脂乳粉的浓度增加时，其粘性也相对的增加，从而影响了乳酸菌的计数。

海藻糖浓度对微胶囊冷冻干燥的影响。将海藻糖（0g/L，10g/L，20g/L，30g/L，40g/L，50g/L）分别加入混合乳液中，制备乳酸菌微胶囊冻干品，以冷冻干燥后的乳酸菌的存活率作为考察指标，研究不同浓度的海藻糖对微胶囊乳酸菌存活率的影响。

正交试验。在以上单因素实验的基础上，选择各个因素的合适水平进行正交试验，以冷冻干燥后微胶囊中乳酸菌的存活率为考察指标，筛选出保护剂对乳酸菌微胶囊冷冻干燥影响的最佳浓度配比。

数据通过SPSS12.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVE），并通过LSD法检验做两两比较。以P<0.05为显著差异。正交实验通过正交设计助手Ⅱ3.1进行设计。每次实验均设置3个平行对照。

由上表分析可知：影响乳酸菌微胶囊冷冻干燥菌存活的因素的主次顺序是海藻糖含量B>脱脂乳粉含量。单因素方差分析显示，与对照组相比，所有添加保护剂的试验中的存活率都提高显著（P<0.05）。由表可以看出，保护剂最佳含量配比为A₂B₂即脱脂乳粉60g/L，海藻糖20g/L，其A2B，所测得的乳酸菌微胶囊冷冻干燥后的活菌数为9.93×10¹⁰cfu/g，菌存活率为96.7%，比未添加保护剂的对照组提高了近3个数量级，因此通过正交试验优化出的冷冻干燥保护剂组合能显著提高冻干胶囊的活菌数。

乳酸菌微胶囊储存稳定性实验。将未微胶囊化乳酸菌（A）、未添加保护剂乳酸菌微胶囊（B）、添加保护剂乳酸菌微胶囊（C）、未添加保护剂冻干乳酸菌微胶囊（D）以及添加保护剂冻干乳酸菌微胶囊（E）一起置于冰箱中4℃冷藏条件下，测定微胶囊的存储稳定性。

随着储存时间的延长，乳酸菌的存活率均成不断下降趋势。单因素方差分析显示：所有微囊化乳酸菌实验组在低温4℃下存储60天后存活率与未微胶囊化的乳酸菌相比有显著差异（P<0.05）。未微囊化的乳酸菌随着储存天数的增加，其活菌数急剧下降，60天后其存活率只有9.7%左右；而其他四组微囊化的乳酸菌的活菌数却下降缓慢，60天后其存活率都保持在80%以上，活菌数仍然维持在10¹⁰cfu/g。微胶囊化能使乳酸菌隔绝外部的氧环境，使其更好的存活，从而显著提高了乳酸菌在低温4℃下储存活性将微胶囊化的四组实验数据进行对比并单因素方差分析可以看出，添加保护剂冻干微胶囊和添加保护剂微胶囊在低温4℃条件下存储60天后的活菌数与未添加保护剂冻干微囊和未添加保护剂的微囊存储60天后的活菌数比较有显著差异（P<0.05）。添加保护剂冻干微胶囊在在低温4℃条件下存储60天后的活菌数下降最慢，其存活率高达96.1%，活菌数为9.58×10¹⁰cfu/g。添加保护剂微胶囊次之，其乳酸菌的存活率仍然高达93.5%，要比未添加保护剂冻干微囊和未添加保护剂的微囊存储60天后的菌存活率高出10%左右。因此，添加冷冻干燥保护剂不仅提高了微胶囊冷冻干燥过程中乳酸菌的存活率，而且显著提高了微胶囊在低温4℃条件下的存储稳定性。主要原因可能是：乳酸菌在低温下处于休眠状態，其代谢是相对静止的：保护剂的添加有助于提高乳酸菌微囊恶劣环境的抵抗能力

结论

以微胶囊冷冻干燥后乳酸菌的存活率为考察指标，研究了脱脂乳粉浓度、海藻糖浓度等因素对微胶囊冷冻干燥的影响，并对其影响机理进行了分析。然后，在单因素的基础上，选取两因素的合适水平进行正交试验，筛选出冷冻干燥后提高乳酸菌存活率的保护剂最佳浓度配比。

确定了最佳的冷冻干燥保护剂含量配比：脱脂乳粉60g/L，海藻糖20g/L。在此最佳保护剂含量配比下，所制备的微胶囊冷冻干燥后乳酸菌存活率为96.7%，活菌数为9.93×10¹⁰cfu/g，比未添加保护剂的对照组提高了近3个数量级。

无论是单一的保护剂还是复合保护剂都能够显著提高乳酸菌微胶囊冷冻干燥后的活菌数，与未添加保护剂的对照组有显著差异（P<0.05）。

复合保护剂与单一保护剂相比，能提高乳酸菌微胶囊冷冻干燥后的活菌数。在最佳保护剂含量配比下，所制备的微胶囊冷冻干燥后活菌数9.93×10¹⁰cfu/g比添加单一保护剂海藻糖的微胶囊冷冻干燥后最高乳酸菌活菌数7.81×10¹⁰cfu/g还要高出1倍多。

不同的保护剂各有优缺点，单一保护剂不能满足菌体抵抗外界恶劣的条件。冷冻干燥过程中添加海藻糖和脱脂乳粉两种不同的保护剂相互补充，脱脂乳粉可以在细胞的表面形成一个稳定的保护层；而海藻糖形成玻璃态，具有高黏度、较小的自由体积、受限制的分子流动性和在贮存中抵抗相分离和结晶的能力等优点，可以使细胞比通透性降低，从而起到保护作用。

微胶囊在4℃存储实验显示，所有实验组随着时间的延长，乳酸菌的存活率均成不断下降趋势。而微胶囊化乳酸菌与原菌液相比能显著提高乳酸菌的存活率（P<0.05）。随着存储时间的延长，原菌液细胞存活率急剧下降，60天后只有9.3%，而微胶囊化实验组存储60天后存活率均在80%以上。可见微胶囊化能显著提高乳酸菌在4℃下的存储活性。

在4 oc存储下，添加保护剂冷冻干燥后的微胶囊细胞存活率下降最慢，60天后仍然高达96.1%，活菌数为9.58×10¹⁰cfu/g。而未添加保护剂的微囊细胞存活率下降最快，只有82.6%。可见，添加保护剂能显著提高微胶囊化乳酸菌在4℃存储活性。