水中粪大肠菌群的多管发酵法检测研究进展

2016-05-14王朝霞

现代农业科技 2016年7期

关键词：质量控制检测

王朝霞

摘要多管发酵法是粪大肠菌群检测的经典方法，概述了其检测意义、发展历程、质量控制以及与其他方法的对比等方面的研究进展，以期为加强对多管发酵法的认识和理解提供参考。

关键词水；粪大肠菌群；多管发酵法；检测；质量控制

中图分类号 X832 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）07-0205-01

1 粪大肠菌群的检测意义

粪大肠菌群是在44.5 ℃培养，24 h内能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，其数量直接表明水体受粪便污染的程度。1992年，生活饮用水卫生标准修订会议上首次提出将粪大肠菌群作为粪便污染的重要卫生学指标[1]。粪大肠菌群是当前国内、外环境监测部门评价水体污染程度的公认指标和主要监测项目之一，具有广泛的卫生学意义[2]。2014年6月起修订施行的《GB4789.39—2013食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数》将粪大肠菌群在食品微生物检验中由推荐检测变成了强制检测[3]。

2 多管发酵法的发展历程

多管发酵法测定粪大肠菌群是国内外沿用多年的方法，在我国，多管发酵法自1989年版《水和废水监测分析方法》到2007年国家环境保护行业标准（HJ/T347—2007），仍为经典方法[4]。该方法技术要求相对较低，分析成本亦较低，便于进行普及和推广。但该方法操作步骤繁杂，消耗大量人力物力，周期长，为此很多人在方法改进上下了不少功夫[5-10]。

3 多管发酵法的质量控制

在微生物检测中，不确定度主要来源于操作人员技能、计量器具校准、培养条件、培养基、样品的均匀性等[11]，因此要保证检测的准确度必须从以上几个方面进行质量控制。

3.1 操作人员技能

为减少样品检测的不确定度，应定期或不定期地对实验室分析人员进行各项专业技术训练和实验室基本操作，及时排除各类问题以提高实验室工作成效。

3.2 实验设备质量控制

恒温培养箱：需每天检查2次，记录培养架上使用区的温度是否准确和稳定，温度变化不可超过±0.5 ℃。

高压蒸汽灭菌器：应能提供均匀的高达121 ℃的高压灭菌温度，每月用热变色滤纸条检查灭菌效果。

紫外灭菌灯：每月用浸有乙醇的湿布擦拭1次，每季用紫外光度计测量紫外灯光强度不少于初始值的70%或用生长有200～250个细菌菌落的琼脂平皿暴露于紫外灯下2 min，99%的菌数被杀灭，否则，即应更换新灯[12]。

为保证仪器计量精确以及正常使用，应该由熟悉仪器的人员定期对仪器进行维护，并按计量部门的要求定期进行检定；肉汤中倒管的选择要尺寸合适，太细太长容易排气不畅，导致灭菌后的倒管内有气泡，在进行发酵实验时产生假阳性现象，太短灭菌过程中肉汤沸腾，容易导致倒管翻转。

3.3 培养条件

复发酵用提高培养温度的方法将粪便中的大肠菌群与自然环境中的大肠菌群区分，接种后如不尽快升温，那些在44.5 ℃以下生长的非粪大肠菌群类细菌就会发酵乳糖产酸产气，这样就会提高复发酵阳性率，因此标准要求“接种后所有发酵管必须在30 min 内放进水浴中”[13]。并且将接种好的样品放入生化培养箱时，箱内温度达到（44.5±0.5） ℃方可放入。如用恒温水浴箱时，其水面要高于接种物面。

3.4 培养基

每一批次的培养基[14]，要用阴阳性菌株验证其有效性；培养基溶解后和灭菌后分别测量pH值，以保证细菌生长所需的pH值；配制后的培养基，要尽快分装到试管中进行灭菌，以免细菌繁殖破坏培养基的营养成分；培养基在高压灭菌器灭菌结束后，当气压降至0后，应立即从灭菌器中取出培养基，使之冷却；震动可能在内置倒管内产生气泡从而产生假阳性结果，因此在使用之前要检查试管，将有气泡的培养基废弃掉；配制好的培养基，不宜保存过久，且每批应注明配制日期。已灭菌的培养基可在4～10 ℃存放7 d；存放时应避免阳光直射，且要避免液体蒸发和杂菌侵入；当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。肉汤管水分散失的简单检查方法是标记每一批次的几根管的原始水平，如果估算的水分散失超过10%，应废弃肉汤管。

3.5 样品均匀性

样品在接种前，应充分振摇，使菌落尽可能分散分布。

4 各种检测方法的对比

随着环境及食品问题的日益严峻，对粪大肠菌群的检测要求不断增加，各种应急监测的需求不断增大，多管发酵法因其操作步骤繁杂、检测周期长、培养基保存时间短、工作量大、干扰因素多、需要消耗大量的人力和物力的缺点，已经不能满足当前国内外的检测需求，因而国内外相继研发出各种快速简便的检测方法，下面对各种检测方法进行对比。

滤膜法：可检测体积较大的水样，操作简单，一次到位，避免操作过程中的二次污染；稀释度越大，误差越大；受孔径影响，不能检测浊度大、非大肠杆菌类细菌密度大的水样[15]。

纸片法：人力物力成本不高，检测周期短，不需要确认试验，操作和结果判断均比较容易，与多管发酵法的相关性好，但其稳定性不足，二次污染大[16-17]。

酶底物法：操作简便，检测周期短，准确度高，不需要确认试验，可同时检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌的污染状况，可作为应急监测或者灾害监测的重要方法[18]。不受浊度的影响，适用于任何水质。密封培养技术检测医院废水时，可以避免检测人员受到疾病威胁[19]。缺点是成本较高。

聚合酶链式技术、荧光原位杂交技术以及自动化检测方法等先进的方法，检验周期短，不需要确认实验，但这些先进的技术检测设备及试剂费用高昂，技术复杂，还无法短时间内应用普及[20]。

5 结语

随着技术的进步和经济的发展，各种先进的检测技术一定会取代传统方法，节省时间和人力资源，在新技术支持下，精确、快速、可靠、环保、低廉的自动检测仪器被研发并应用与普及将使自动化检测方法成为监测工作的发展方向。但其他方法的研究都是与多管发酵法进行准确度和可靠性的比较，因此多管发酵法始终是粪大肠菌群检测的经典方法。

6 参考文献

[1] 汤琳.粪大肠菌群酶底物法在环境监测中的应用研究[J].环境监控与预警，2014，6（3）：32.

[2] 史建.粪大肠菌群检测方法研究进展[J].河北化工，2012，35（7）：32-35.

[3] 郭盈希.食品微生物粪大肠菌群计数新旧标准比对分析[J].中国食物与营养，2014，20（7）：10.

[4] 芦慧，赵淑娥，张云伟，等.24孔板发酵法测定地表水和废水中粪大肠菌群的研究[J].环境科学与管理，2014，39（5）：122-124.

[5] 吕琦，陈之江.快速测定地表水中粪大肠菌群[J].环境监测管理与技术，2003，15（6）：37.

[6] 冯青英，刘娟，杨大卫.粪大肠菌群多管发酵测定法的改进研究[J].中国环境监测，2009，25（6）：43-46.

[7] 谢嵘.五管发酵测定粪大肠菌群的研究[J].干旱环境监测，2004，18（3）：191-192.

[8] 谢嵘.十管发酵测定粪大肠茵群的研究[J].黑龙江环境通报，2009，33（4）：37-39.

[9] 张济龙，何吉明，袁泉，等.多管发酵法与其改进法检测水中粪大肠菌群的比较[J].四川环境，2012，31（5）：8-11.

[10] 杨虹，刘金冠，郭玉敏.酶底物法与多管发酵法测定水中粪大肠菌群的对比分析[J].现代农业科技，2015（20）：162.

[11] 李永.多管发酵法测定污水中粪大肠菌群结果不确定度的评定[J].广东化工，2013，40（21）：146-147.