杨硕，苏畅，张永亮,3，李建宇，李灵芝,3(天津医科大学药学院，天津300070；武警后勤学院；3天津市职业与环境危害防制重点实验室)



急性低压缺氧大鼠脑组织中细胞红蛋白、MDA、SOD、CAT的表达变化

杨硕1，苏畅2，张永亮2,3，李建宇1，李灵芝2,3(1天津医科大学药学院，天津300070；2武警后勤学院；3天津市职业与环境危害防制重点实验室)

摘要：目的观察急性低压缺氧不同时点大鼠脑海马区细胞红蛋白(Cygb)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)表达的时序性变化特点。方法 将100只成年雄性SD大鼠随机分为常氧对照组及低压缺氧6、12、18、24 h组，每组20只。除常氧对照组外，其他各实验组大鼠置于低压缺氧舱内建立大鼠急性低压缺氧模型。采用甲苯胺蓝染色法观察各组大鼠脑海马区形态学改变；采用分光光度法检测各组脑组织MDA、SOD、CAT活性。采用RT-PCR技术检测各组脑海马区Cygb mRNA表达。采用激光共聚焦显微镜观察各组大鼠脑海马中Cygb的荧光表达定位及时序性变化特点。结果甲苯胺蓝染色显示随低压缺氧时间的延长，各缺氧组大鼠脑海马区神经细胞中胞核由蓝色淡染变为蓝色深染，胞质中Nissl体减少，变成粉状或消失。与常氧对照组相比，各缺氧组大鼠脑组织中MDA水平上升，SOD、CAT活性均降低，P均<0.05。免疫荧光化学染色显示各缺氧组大鼠海马区神经细胞中Cygb荧光强度随缺氧时间延长而逐渐增加。Cygb mRNA表达随缺氧时间的延长逐渐增加(P均<0.05)，且呈时间依赖性。结论 急性低压缺氧大鼠脑海马区Gygb表达、MDA水平升高，SOD、CAT活性降低，且随缺氧时间的延长而变化。

关键词：低压缺氧；细胞红蛋白；氧化应激；海马组织；大鼠

研究[1,2]表明，急性缺氧或长期处于慢性缺氧环境均可能导致脑组织不可逆性损伤。缺氧可诱导大鼠脑组织中细胞红蛋白(Cygb)应激性增加，对脑缺氧损伤起保护作用[3，4]。但目前尚未见关于急性低压缺氧后脑海马区Cygb的表达定位、时序性变化及其与损伤关系的研究报道。2015年2～9月，我们建立大鼠急性低压缺氧模型，通过组织学观察、大鼠脑组织丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及海马区Cygb检测，研究大鼠脑海马组织的缺氧损伤情况及Cygb表达水平变化，探讨Cygb与高原缺氧性脑损伤的关系。

1材料与方法

1.1材料药品与仪器：考马斯亮蓝G250试剂盒、CAT试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒(南京建成生物工程公司)；山羊抗Cygb多克隆抗体(santa cruz)、正常兔血清、TRITC标记兔抗山羊IgG(北京中杉生物有限公司)；抗荧光衰减封片剂(北京Applygen公司)；TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒、DL-2000 Markers(宝生物工程有限公司)；TRIzol Reagent(Invitrogen公司，美国)。数控低压缺氧舱(烟台宏远氧业有限公司)；高速低温离心机(Eppendorf公司，德国)；超低温冰箱(Sanyo公司，日本)；组织切片机(Leica公司，德国)；E-510型多功能显微镜(Olympus公司，日本)。动物：体质量290～320 g清洁级成年雄性SD大鼠100只(军事医学科学院实验动物中心)。

1.2急性低压缺氧损伤模型的建立及分组运用随机数字表法将100只大鼠随机分为5组，分别设为常氧对照组、低压缺氧6 h组、低压缺氧12 h组、低压缺氧18 h组和低压缺氧24 h组，每组20只。饲养7 d适应环境。除常氧对照组外，各组大鼠均入舱进行低压缺氧。调节舱内压力在20 min内降至真空度-0.06 MPa(相当于海拔7 000 m大气压力)。实验过程中维持氧水平为(10±2)%，温度为(20±3)℃，湿度为(65±5)%。实验结束后20 min内使缺氧舱内升至正常气压。常氧对照组大鼠相同温度、湿度下于舱外正常饲养。

1.3各组大鼠脑海马区形态学观察各组大鼠出舱后迅速于冰浴下断头取脑组织，用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，取海马区脑组织石蜡包埋，连续切片，甲苯胺蓝染色，梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

1.4各组大鼠脑组织中SOD、CAT活性及MDA含量检测各组大鼠出舱后迅速于冰浴下断头取脑，剥除脑膜并用预冷的PBS冲净表面血液。吸干表面水分称重，冰浴下加PBS匀浆，离心10 min(4 ℃、3 000 r/min)，吸取上清，按试剂盒说明书方法检测样品SOD、CAT活性及MDA水平，同时测定样品蛋白水平。

1.5各组大鼠海马区神经细胞中Cygb荧光强度检测采用免疫荧光染色。将石蜡切片常规脱蜡、脱水，PBS漂洗，加0.4%胃蛋白酶37 ℃下孵育30 min，0.01 mol/L PBS漂洗、吹干，滴加10%兔血清室温孵育30 min，滴加50 μL兔抗大鼠Cygb IgG多克隆抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜。室温放置30 min后用0.01 mol/L PBS漂洗。避光下滴加TFITC标记的羊抗兔抗体50 μL(1∶100)，于37 ℃孵育45 min，0.01 mol/L PBS漂洗。加抗荧光衰减封片剂封片，4 ℃避光保存。空白对照用PBS代替一抗，其他处理相同。以568 nm为激发波长，617 nm为发射波长，激光共聚焦显微镜下观察并摄像。Cygb阳性细胞显示红色荧光。

1.6Cygb mRNA表达检测采用RT-PCR法。取大鼠海马区脑组织约100 mg，提取总RNA，分别采用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法测定RNA水平和RNA完整性。按试剂盒说明合成cDNA，产物进行PCR反应，扩增产物长度为81 bp[5]。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像分析系统分析，计算各组Cygb扩增带的吸光度(Af)与β-actin扩增带的吸光度(Ab)间的比值。

2结果

2.1各组甲苯胺蓝染色组织形态学变化常氧对照组大鼠脑海马各区细胞形态完整，胞核呈蓝色淡染，胞质中可见大量深蓝色的粗颗粒状Nissl体。低压缺氧6 h组大鼠脑海马CA1区神经细胞呈蓝色深染，CA2、CA3、CA4区神经细胞损伤逐渐减轻，呈蓝色淡染，Nissl体减少或消失。缺氧12、18和24 h组：大鼠脑海马各区神经细胞数量明显减少，呈不规则状稀疏排列，大部分细胞胞核破碎，细胞均蓝色深染，且Nissl体几乎全部消失；损伤随着缺氧时间的延长逐渐加重，且海马各区的损伤程度以CA1区最为严重，CA2、CA3及CA4区损伤逐渐减轻。

2.2各组SOD、CAT活性及MDA水平变化与常氧对照组相比，各低压缺氧组大鼠脑组织中SOD、CAT活性均降低(P均<0.01)，且随低压缺氧损伤时间的延长逐渐递减。与常氧对照组相比，缺氧12 h组大鼠脑组织MDA水平开始明显上升(P<0.05)，缺氧18 h组和24 h组MDA水平升高更显著(P均<0.01)。见表1。

表1　　　　各组大鼠脑组织中SOD、CAT活性及MDA水平

注：与常氧对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与低压缺氧6 h组相比,#P<0.05,##P<0.01;与低压缺氧12 h组相比,△△P<0.01;与低压缺氧18 h组相比,▲▲P<0.01。

2.3各组免疫荧光染色结果在大鼠脑海马组织中，Cygb免疫荧光阳性表达细胞呈红色荧光。常氧对照组Cygb在大鼠脑海马各区中均有微弱表达，部分海马锥形细胞胞核和胞质中可见阳性信号出现，且主要集中于核膜和核仁周围呈不规则分布；低压缺氧6 h组Cygb表达增加，且在轴突及树突中也有阳性信号出现；缺氧12 h组海马区大部分神经细胞皱缩变形，胞核固缩或破裂，Cygb表达进一步增加；缺氧18 h和24 h组中大量锥形细胞坏死和凋亡，胞核破碎或溶解，但仍可见Cygb在胞质及胞核区表达显著增加。

2.4各组Cygb mRNA表达比较随低压缺氧时间的延长，大鼠脑海马组织中Cygb mRNA的表达逐渐增高，表现出时间依赖性；常氧对照组中Cygb mRNA呈低表达，与之相比，低压缺氧损伤6 h组Cygb mRNA表达显著升高(P<0.05)，低压缺氧12 h、18 h及24 h组Cygb mRNA表达进一步升高(P均<0.01)。见表2。

表2　　　　各组大鼠脑海马组织中Cygb mRNA表达

注：与常氧对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与低压缺氧6 h组相比,##P<0.01;与低压缺氧12 h组相比,△△P<0.01;与低压缺氧18 h组相比,▲P<0.05。

3讨论

Iswar等[6]研究表明，缺氧会影响大鼠脑学习和记忆功能。Mishra等[7]研究发现，负责学习和记忆等功能的海马体对缺氧性损伤比脑皮质更为敏感。本研究发现缺氧6 h组神经细胞受损较轻，主要表现为Nissl体减少或消失。随着缺氧时间的持续延长，海马各区神经细胞损伤程度逐渐加重，均出现不同程度的细胞数量明显减少，胞质蓝色深染，Nissl体完全消失。且海马各区损伤程度不同，以CA1区损伤最严重，CA2、CA3及CA4区损伤程度逐渐减轻，这可能是因为CA1区是海马体对缺氧最为敏感的部位[8]。

正常细胞内存在自由基的清除系统，常见的自由基清除系统主要有SOD、CAT等。SOD是清除系统的第一道防线，可将O2-转化为H2O2或其他氢过氧化物。CAT和其他酶共同组成第二道防线，其作用是清除过氧体系中产生的H2O2。因而测定脑组织中SOD、CAT活性可作为氧自由基生成量的间接指标[3]。当机体缺氧时，细胞中可产生大量氧自由基，过量的氧自由基可激发链式脂质过氧化反应，并形成脂质过氧化产物(如MDA)，对细胞膜造成损伤。脑组织MDA的水平可间接反映低压缺氧时脑组织受自由基攻击的严重程度[9,10]。通过检测脑组织中SOD、CAT活性和MDA水平可间接反映低压缺氧导致的大鼠脑损伤程度。本研究证实，低压缺氧可致大鼠脑组织SOD和CAT活性降低，且呈时间依赖性，与之相反，各缺氧组大鼠脑组织MDA水平与对照组相比均明显升高，且随缺氧时间的延长呈递增趋势，与脑组织病理学改变一致。提示急性低压缺氧可引起脑组织氧自由基蓄积，破坏自由基清除系统，从而诱导大鼠脑损伤。

Cygb是携氧球蛋白家族成员，具有储存和传递氧气的功能[11]。Schmidt 等[5]研究发现，缺氧时在脑组织某些特定区域中能观察到Cygb表达，提示Cygb可能与脑缺氧密切相关。Avivi等[12]的研究证实了这一观点，他们发现缺氧可诱导鼹形鼠脑组织Cygb表达上调，可能对脑缺氧损伤起到保护作用。本研究证实缺氧后大鼠脑组织Cygb mRNA水平明显上调，与文献结果相符，提示Cygb在保护低压缺氧性脑损伤中起着重要作用。随后通过免疫荧光染色法发现，常氧条件下，大鼠脑海马组织神经细胞胞核和胞质内均有少量Cygb表达，且主要集中于核仁及核膜周围；随低压缺氧时间的延长Cygb表达明显增强，且遍布于细胞胞核、胞质及突起中，提示Cygb作为携氧球蛋白不仅能在细胞胞质中发挥神经保护作用，亦可能作为一种核转录因子转移入胞核，从而调控其他基因的表达。

综上所述，低压缺氧可诱导大鼠脑组织海马各区神经细胞Nissl体减少或消失，破坏自由基清除系统，产生氧化应激损伤，最终导致低压缺氧性脑损伤，且损伤程度随缺氧时间的延长加剧；Cygb表达的时序性变化特点提示其可能对急性低压缺氧性脑损伤起到保护作用。

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(收稿日期：2015-11-05)

中图分类号：R651.15

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)13-0030-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.011

通信作者：李灵芝(E-mail：13682196000@163.com)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81471823)；天津市重点基金资助项目(12JCZDJC34700)；武警后勤学院创新团队课题(WHTD201303)。