崔晓腾，高星杰，张春燕，付雪，苏超，任媛媛，杨洁(天津医科大学，天津 300070)



pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建及鉴定

崔晓腾，高星杰，张春燕，付雪，苏超，任媛媛，杨洁(天津医科大学，天津 300070)

摘要：目的构建并鉴定pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒，为深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病的生物学作用奠定基础。方法提取HeLa细胞总RNA，反转录出含Argonaute1的cDNA；以Argonaute1 cDNA为模板，采用PCR法扩增出带有EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切的目的基因；采用双酶切法将目的片段连接到pmCherry-C1载体上；将构建成功的pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒转染入HeLa细胞内，以Western blotting法检测Argonaute1与樱桃红(Cherry)蛋白的融合表达情况；以激光共聚焦显微镜观察细胞内Argonaute1蛋白与细胞应激颗粒的标记蛋白(G3BP)及加工体的标记蛋白(DCP1α)的应激共定位关系。结果以EcoRⅠ、BamHⅠ单、双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误；融合蛋白表达阳性；当细胞受到应激时，Argonaute1蛋白与G3BP、DCP1α蛋白共定位。结论本研究成功构建重组pmCherry-C1-Argonaute1质粒。该质粒可有效表达Cherry标记的Argonaute1融合蛋白，有助于深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病领域的生物学作用。

关键词：人类Argonaute1蛋白；pmCherry-C1；重组质粒；融合蛋白；应激颗粒

应激蛋白Argonaute1是一种多功能蛋白，参与RNA干扰及应激颗粒(SGs)、加工体(PBs)形成等多种细胞生物学过程[1～3]。pmCherry-C1是一种可以编码红色荧光蛋白的真核表达载体。2015年9～11月，本研究通过基因工程技术将Argonaute1基因片段连接至pmCherry-C1载体，构建pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒，旨在为深入研究Argonaute1蛋白的细胞生物学功能提供便利工具。

1材料与方法

1.1材料质粒、菌株及细胞： pmCherry-C1载体由Johan Perane博士馈赠，感受态大肠杆菌Trans1购自天津科仪嘉欣科技有限公司，HeLa细胞来自本实验室。酶类及主要生化试剂：限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA 连接酶均购自Thermo Fisher Scientific公司，Taq酶购自北京鼎国昌盛生物技术公司，T/A载体(pEASY-T1)购自北京全式金生物技术有限公司，B型小量DNA快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，质粒快速提取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒购自Promega公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司，LumiGLo化学发光底物购于KPL公司。抗体：兔抗人Argonaute1单克隆抗体购自CST公司，鼠抗人G3BP单克隆抗体和兔抗人DCP1α抗体购自abcam公司，鼠抗人樱桃红蛋白(Cherry)单克隆抗体购自MBL公司，蓝色荧光(Alexa Fluor 350)标记的驴抗鼠荧光二抗和绿色荧光(Alexa Fluor 488)标记的驴抗兔荧光二抗购自Invitrogen公司，辣根过氧化物酶标记的抗鼠和抗兔IgG二抗购自KPL公司。引物合成及基因测序由北京天一辉远公司完成。

1.2pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒构建

1.2.1Argonaute1蛋白目的片段获取提取HeLa细胞的总RNA，以TGGACCAAAAGGGGCAGCACTGGTGCCC序列进行Argonaute1的cDNA扩增；根据CDS序列(NM_012199.2)设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点的引物序列，即 F：5′-CCGGAATTCCATGGAAGCGGGACCCTCGGGAG-3′;R：5′-CGCGGATCCTCAAGCGAAGTACATGGTGCGC-A-3′；以反转录的Argonaute1 cDNA为模板，扩增PCR目的片段，条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 3 min，共15个循环，每次循环降低1 ℃，再以50 ℃进行20个循环，72 ℃延伸10 min；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段，并将目的片段与pEASY-T1(T/A载体)于25 ℃连接15 min。连接产物转化Tran1-T1感受态细胞，置于含有氨苄/卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取质粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，凝胶回收试剂盒回收并纯化目的片段。

1.2.2线性pmCherry-C1质粒载体获取以质粒快速小提试剂盒提取pmCherry-C1质粒，进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，完整切下呈线性的pmCherry-C1质粒载体，以1%琼脂糖电泳分离，再以凝胶回收试剂盒回收pmCherry-C1线性载体(约4 700 bp)。 在T4 DNA连接酶作用下，将线性pmCherry-C1质粒载体与具有相同黏性末端的Argonaute1功能片段于22 ℃下连接并过夜。连接产物转化感受态细菌大肠杆菌Trans1，在含有卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取重组质粒。

1.3pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒鉴定

1.3.1酶切及基因测序采用EcoRⅠ和BamHⅠ对重组质粒pmCherry-C1-Argonaute1进行单、双酶切鉴定，并以1%琼脂糖凝胶电泳验证片段大小；同时对重组质粒进行基因测序鉴定。

1.3.2融合蛋白检测采用Western blotting法。以预冷的1×NP-40裂解液裂解细胞，超声破碎细胞后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清获取全细胞裂解液，以BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。裂解液中加入SDS上样缓冲液(pH 6.8的50 mmol/L Tris-Cl、2% SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、2.5% β-巯基乙醇)，99 ℃热变性10 min，8% SDS-PAGE电泳；以半干转法将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭3 h；加入兔抗人Argonaute1单克隆一抗或鼠抗Cherry一抗，4 ℃孵育过夜；TBST 溶液洗膜3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG二抗室温孵育2 h；TBST溶液再次洗膜3次，每次10 min；加入LumiGLo化学发光底物后暗室曝光。

1.3.3三色荧光共定位分析以去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素重组质粒。将细胞接种于激光共聚焦皿中，以含10 % FBS的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞达80%融合时，进行脂质体瞬时转染pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒。转染后48 h给予0.5 mmol/L亚砷酸盐处理1 h，以4%多聚甲醛室温固定10 min，以高压过的PBS缓冲液洗涤2次、5 min/次。以1%通透液(含0.2% Triton X-100的PBS)室温静置通透10 min；加入1% BSA封闭1 h；加入G3BP(1∶250)和DCP1α(1∶100)一抗混合液，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，10 min/次；加入蓝色荧光标记驴抗鼠(1∶800)与绿色荧光标记驴抗兔(1∶800)二抗混合液，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，10 min/次。以不含DAPI的细胞荧光封片液封片并过夜，以激光共聚焦显微镜观察细胞内红、绿、蓝三色荧光信号。

2结果

2.1Argonaute1目的片段PCR扩增目的片段长度约为2 574 bp，见图1。

注：1为DNA Marker；2为PCR产物。

2.2线性pmCherry-C1质粒载体完整的线性pmCherry-C1质粒载体(见图2)经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后，在4 722 bp左右出现条带(图3)，纯化回收后用于后续的连接反应。

图2　pmCherry-C1 质粒图谱

注：1为DNA Marker；2为pmCherry-C1质粒；3为EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后产物。

图3线性pmCherry-C1质粒载体

2.3重组真核表达质粒pmCherry-C1-Argonaute1 鉴定结果

2.3.1酶切及基因测序将构建的重组质粒分别进行EcoRⅠ和BamHⅠ的单、双酶切，产生的条带大小与预期相符(见图4)，重组质粒基因测序结果正确，证明Argonaute1功能片段已成功插入到pmCherry-C1的多克隆位点上。

注：1为DNA Marker；2为pmCherry-C1-Argonaute1质粒；3为EcoRⅠ单酶切产物；4为BamH Ⅰ单酶切产物；5为EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切产物。

图4重组真核表达质粒pmCherry-C1-Argonaute1的

EcoRⅠ、BamHⅠ单、双酶切产物

2.3.2融合蛋白表达Argonaute1蛋白、Cherry蛋白融合后分子量为89.7 KDa，Western blotting法检测的蛋白条带与目的融合蛋白分子量相符(见图5)，表明Cherry-Argonaute1融合蛋白表达成功。

图5　Western blot法检测融合蛋白结果

2.3.3三色荧光共定位转染构建的重组质粒pmCherry-C1-Argonaute1，可在细胞内发现荧光信号，当细胞受到氧化应激时Cherry-Argonaute1可在胞质内形成红色的颗粒状结构，与SGs的标志蛋白G3BP(蓝色)、PBs的标志蛋白DCP1α(绿色)颗粒结构均呈共定位关系。见图6。

图6　　　　激光共聚焦显微镜下观察重组质粒

3讨论

Argonaute1蛋白家族是一类相对分子量约为100 KDa的序列保守蛋白，表达于人、果蝇、拟南芥等多个物种[4～6]。Argonaute1蛋白家族包括多个成员，多含有月牙状的PAZ和具有潜在核酸内切酶活性的PIWI结构域，参与miRNA、siRNA、piRNA等多个非编码小RNA的细胞生物学过程[6～8]。研究发现，Argonaute1是RNA诱导沉默复合体的核心元件，与siRNA生成、靶mRNA降解、细胞应激等过程密切相关[1,6]。

生物体的生存环境复杂多变，机体细胞为应对氧化应激、渗透压休克、热休克、紫外线辐射和病毒感染等多种外界刺激而建立相应的“应激反应体系”，以保持细胞旺盛的生命力。转录后基因调控机制是其中至关重要的环节，它可调控胞质内RNA代谢、暂时抑制应激细胞中蛋白的翻译过程、节省细胞内合成代谢的原料和能量、优先表达应激所特需的蛋白等[9]。SGs和PBs是细胞受到应激时在胞质内形成的与RNA代谢密切相关的颗粒状结构[10～12]。这两种颗粒结构实质上是一系列蛋白、核酸的聚集体。随着研究的深入，不断有新的应激蛋白被发现[10]。其中，Argonaute1蛋白同时参与细胞中SGs和PBs的形成[13～15]。通过基因工程的方法对Argonaute1蛋白进行荧光蛋白标记，可用于探讨Argonaute1蛋白在细胞应激中的作用。Cherry是四聚体Discosoma sp.红色荧光蛋白的一个突变体，荧光强度及抗光漂白能力均有所提高。pmCherry-C1载体允许目的基因片段插入Cherry蛋白基因的C端，形成红色荧光标记的目的蛋白。本研究通过构建pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的方法对Argonaute1蛋白进行Cherry的荧光标记。在Western blotting实验中发现，利用抗内源性Argonaute1抗体可以检测出两个条带，而抗Cherry抗体检测出一个条带，表明pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒能够在活细胞内成功表达Cherry与Argonaute1的融合蛋白。当细胞受到亚砷酸盐氧化应激刺激时，Cherry标记的Argonaute1蛋白可与应激颗粒(以G3BP蛋白为标记蛋白)和加工体(以DCP1α为标记蛋白)均呈共定位关系，说明Argonaute1蛋白为细胞应激和加工体的共同成员。

总之，本研究成功构建了重组pmCherry-C1-Argonaute1质粒，其可有效表达Cherry标记的Argonaute1融合蛋白；上述结果有助于深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病研究领域的生物学作用机制。

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Construction and identification of recombinant plasmid pmCherry-C1-Argonaute1

CUIXiaoteng,GAOXingjie,ZHANGChunyan,FUXue,SUChao,RENYuanyuan,YANGJie

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:ObjectiveTo construct and identify the recombinant plasmid pmCherry-C1-Argonaute1 and to provide the basis for further research on the biological role of Argonaute1 protein in the field of cell stress and its related diseases. MethodsThe total RNA was extracted from Hela cells and cDNA containing Argonaute1 was inverse transcribed. Argonaute1 fragment containing EcoRI and BamHI site was amplified by PCR from purified tamplate from HeLa cell line and inserted into pmCherry-C1 fluorescent expressing vector. The recombinant pmCherry-C1-Argonaute1 plasmid was transfected into HeLa cells and the expression of red fluorescent fusion proteins was examined by Western blotting and the co-localization in stress condition of Argonaute1 and G3BP (biomarker in stress granules) and DCP1α (biomarker in processing bodies) was detected by fluorescence microscope. ResultsThe recombinant plasmid was sequenced correctly which was identified by EcoRI, BamHI, the restriction single/double enzyme digestion and gene sequencing. The red fluorescent fusion protein was also detected in transfected HeLa cell by Western blotting. The result of three-color immunofluorescence co-localization indicated that Cherry-red labeled Argonaute1 was co-localized with G3BP and DCP1α in cells under stress condition. ConclusionsThe recombinant eukaryotic plasmid of pmCherry-C1-Argonaute1 is constructed successfully and expresses Cherry-red labeled Argonaute1 fusion protein effectively . These results will help to study the biological role of Argonaute1 in cell stress and related diseases.

Key words:human Argonaute1 protein; pmCherry-C1; recombinant plasmid; fusion protein; stress granules

(收稿日期：2016-01-06)

中图分类号：Q591.2,Q784

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)12-0009-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.003

通信作者简介：杨洁(1968-)，女，博士生导师，教授，主要研究方向为细胞生物学、细胞分子通路。E-mail: yangj@tijmu.edu.cn

第一作者简介：崔晓腾(1990-)，男，硕士研究生，主要研究方向为细胞生物学。E-mail: xiaotengcui@gmail.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31370749/31571380)；国家杰出青年基金资助项目(31125012)；教育部“创新团队发展计划”(IRT13085)；天津市应用基础与前沿技术研究计划(15JCQNJC09900)。