蔡建星，轩慧勇，夏利宁

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)



不同部位分离的猪源葡萄球菌的耐药情况分析

蔡建星，轩慧勇，夏利宁

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

摘要：【目的】调查新疆昌吉州的某规模化猪场,生猪不同部位(鼻腔和直肠)分离的葡萄球菌耐药情况。【方法】采用微量肉汤稀释法,对不同部位分离出的葡萄球菌,进行临床9种常用抗菌药物的药敏试验；对耐药结果使用SPSS软件进行卡方检验，比较不同部位分离出的葡萄球菌耐药的差异性。【结果】鼻腔分离的葡萄球菌主要对氧氟沙星(89.5%)和克林霉素(89.0%)的耐药率较高。直肠分离的葡萄球菌主要对克林霉素(84.5%)、氧氟沙星(81.0%)和阿米卡星(81.0%)耐药率较高。通过卡方检验分析发现，直肠分离的葡萄球菌对阿米卡星和庆大霉素的耐药率显著高于鼻腔分离的葡萄球菌的耐药率(P<0.05)。鼻腔分离的葡萄球菌仅对苯唑西林的耐药率显著高于直肠分离的葡萄球菌的耐药率(P<0.05)。多药耐药差异性结果显示：鼻腔分离的葡萄球菌以6耐(11.75%)和7耐(9.5%)为主，直肠分离的葡萄球菌以8耐(11.5%)为主。且在8耐和9耐中，直肠分离的葡萄球菌多药耐药率显著高于鼻腔分离的葡萄球菌多药耐药率(P<0.05)。【结论】直肠分离的葡萄球菌对大部分被检抗菌药物的耐药率比鼻腔分离的葡萄球菌耐药率更高，直肠分离的葡萄球菌耐药率比鼻腔分离的葡萄球菌多药耐药情况更加严重。抗菌药物在呼吸道和肠道两种不同感染途径中，肠道耐药率更加严重，在临床用药方面，可结合感染部位的不同，科学的更换抗菌药物。

关键词：猪；不同部位；葡萄球菌；抗菌药物；耐药率

0引 言

【研究意义】葡萄球菌广泛存在于自然环境中。健康动物的皮肤、肠道等都有葡萄球菌存在，同时是环境中的常在微生物。猪葡萄球菌病是造成规模化养猪场仔猪经济损失的主要疾病之一[1]。由于葡萄球菌种类较多，对其所引起的疾病多采用抗菌药物；加之葡萄球菌是革兰氏阳性菌中最易产生耐药性的细菌，导致耐药葡萄球菌越来越普遍[2]，不但削弱临床疗效，造成大量药物残留和毒副作用，而且耐药细菌有在动物和人之间传播的风险，对人类健康造成潜在威胁，已引起全球关注[3]。【前人研究进展】目前，国内很多省市如河南[4]、广州[5]、青岛[6]、宁夏[7]、广东[8]等地对不同来源葡萄球菌的耐药情况进行调查，结果显示不同地区不同来源葡萄球菌菌对抗菌药物的耐药情况不同，且多数研究表明葡萄球菌的耐药率呈现较高的趋势。【本研究切入点】尽管耐药性研究很多，但鲜见对不同部位分离的葡萄球菌耐药情况研究的相关报道，耐药情况不明，是否存在呼吸道与肠道相互交叉感染，导致耐药率升高，尚不清楚。试验以新疆昌吉州的某规模化猪场生猪不同部位分离的葡萄球菌为研究对象，对其进行临床常用抗菌药物的药敏试验。【拟解决的关键问题】了解同一猪场不同部位分离的葡萄球菌耐药差异性比较，获取耐药谱，与其他地区葡萄球菌耐药情况做比较，并指导临床合理用药。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1葡萄球菌

试验于2014年7月在新疆昌吉州某规模化养猪场进行葡萄球菌样品采集。主要是采集同一头猪的直肠肛拭子样和鼻腔鼻拭子样(一猪两样)各200份。标准质控菌(ATCC29213)购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.2培养基

Mueller-Hinton(MH)培养基、BP(Baird-Parker)琼脂基础、亚硫酸铋卵黄增菌液和普通肉汤均购自北京奥博星生物技术有限公司。

1.1.3 试验药品

β-内酰胺类：阿莫西林(Amoxicillin)(MOX，含量86.6%)/克拉维酸(Clavulanic Acid)(A/C，含量100%)、苯唑西林(Benzene)(OX，含量99.5%)；氨基糖苷类：庆大霉素(Gentamicin)(GEN，含量99.5%)、阿米卡星(Amikacin)(AMK，含量65.5%)；喹诺酮类：氧氟沙星(Levofloxacin)(DF，含量99%)；酰胺醇类：氟苯尼考(Florfenicol)(FFC，含量98%)；四环素类：四环素(Tetracycline)(TE，含量95%)；林可胺类：克林霉素(Clindamycin)(CM，含量80%)；福霉素类：利福平(Rifampicin)(RP，含量98.7%)。上述药品均购自中国兽药监察所。

1.2方 法

1.2.1葡萄球菌的分离鉴定

将采集的样品置于灭菌的7.5%氯化钠营养肉汤中，37℃培养18～24 h，初步筛选葡萄球菌。然后用接种环挑取菌液划线转接种在BP琼脂平板上，37℃培养24～48 h，葡萄球菌在BP琼脂平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润的菌落，颜色呈灰色至黑色，挑取可疑单个菌落保存。最后将可疑单个菌落进行革兰氏染色，镜检革兰氏阳性染色为紫色，呈葡萄串状排列，无芽胞，无荚膜，即为葡萄球菌。将确定为葡萄球菌的菌株保菌，以备后期实验用。

1.2.2药物敏感性试验

按美国临床实验室标准委员会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐的微量肉汤稀释法进行，对分离的400株葡萄球菌进行上述9种抗菌药物最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)值测定，结果判定参照CLSI(2012，2013)[9,10]标准。

1.3数据统计

耐药结果差异统计采用SPSS20软件进行卡方检验。

2结果与分析

2.1不同部位葡萄球菌的分离鉴定结果

葡萄球菌是自然界中广泛存在的革兰氏阳性菌。鼻腔和直肠采集的样品中葡萄球菌的分离率均为100%。表1

表1猪源葡萄球菌分离结果Table 1The isolates results of swineStaphylociccus

采集部位Samplesite采样数Numberofsamples分离率(分离数/采样数)Separationrate(thenumberofisolates/samples)鼻腔样Nasalswab(N)200100%(200/200)直肠样Analswab(A)200100%(200/200)

2.2 不同部位分离的葡萄球菌对9种抗菌药物的耐药差异性比较

研究表明，鼻腔分离的葡萄球菌主要对氧氟沙星(89.5%)和克林霉素(89.0%)的耐药率较高，而对庆大霉素(18.5%)耐药率较低；直肠分离的葡萄球菌对克林霉素(84.5%)、阿米卡星(81.0%)和氧氟沙星(81.0%)的耐药率较高，对庆大霉素(36.0%)耐药率较低。对苯唑西林和利福平鼻腔分离的葡萄球菌的耐药率显著高于直肠分离的葡萄球菌的耐药率(P<0.05)；对阿米卡星、庆大霉素和利福平直肠分离的葡萄球菌的耐药率显著高于鼻腔分离的葡萄球菌的耐药率(P<0.05)。然而，对于四环素、氟苯尼考、阿莫西林/克拉维酸和克林霉素不存在显著变化(P>0.05)。除了对克林霉素和氧氟沙星外，直肠分离的葡萄球菌的耐药率高于鼻腔分离的葡萄球菌耐药率，耐药情况更加严重。表2

表2不同部位分离的葡萄球菌对被检药物的耐药率差异显著性比较Table 2Comparison of significant difference of resistance rate of swineStaphylociccusat different site to detected drugs

耐药率Resistancerate(%)AMKGENTEFFCRPDFOXA/CCM鼻腔样N53.3B18.5B57.5a46.5a40.0B89.5B65.0B53.0a89.0a直肠样A81.0C36.0C67.0a54.5a51.5C81.0C59.5C70.5a84.5aN-A-27.7-17.5-9.5-5-11.5+8.5+5.5-17.5+4.5

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标记表示差异不显著(P>0.05)。下同

Note: Peer data shoulder marked differences in capital letters differ significantly (P<0.05); shoulder marked with the same letter or no letter mark indicates that the difference was not significant (P>0.05)

2.3不同部位分离的葡萄球菌对9种抗菌药物多药耐药差异性比较

鼻腔分离的葡萄球菌主要以6耐(11.75%)和7耐(9.5%)为主，直肠分离的葡萄球菌以8耐(11.5%)为主。在1耐、4耐、5耐和6耐中，鼻腔分离的葡萄球菌多药耐药率显著高于直肠分离的葡萄球菌多药耐药率(P<0.05)；在2耐、8耐和9耐中，直肠分离的葡萄球菌多药耐药率显著高于鼻腔分离的葡萄球菌多药耐药率(P<0.05)。表3

表3不同部位分离的葡萄球菌多药耐药差异显著性比较
Table 3Comparison of significant difference of drug resistance ofStaphylococcusin different sites

耐药率Resistancerate(%)0耐1耐2耐3耐4耐5耐6耐7耐8耐9耐鼻腔样N0.5a2.25B2.75B5.25a7.25B6.5B11.75B9.5a3.5B0.75B直肠样A0.0a0.5C3.5C6.5a4.5C4.5C6.5C9.0a11.5C3.5CN-A+0.5+1.75-0.75-1.25+2.75+2.0+5.25+0.5-8-2.75

2.4不同部位分离的葡萄球菌多药耐药谱型结果

400株葡萄球菌对所检测的9种抗菌药物存在154种耐药谱型，鼻腔分离的葡萄球菌耐药谱型主要是6耐和7耐，共85株。6耐的耐药谱型是TE-RP-DF-A/C-OX-CM(12/85，14.1%)，7耐2种谱型分别为TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM(12/85，14.1%)、AMK-TE-RP-DF-A/C-OX-CM(6/85，7.1%)。直肠分离的葡萄球菌耐药谱型主要是8耐和9耐，共63株。8耐2种耐药谱型分别为AMK-TE-RP-DF-A/C-OX-CM(13/63，20.6%)、AMK-GEN-TE-FFC-DF-A/C-OX-CM(13/63，20.6%)。9耐耐药谱型AMK-TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM达到14株，占22.2%。表4

表4不同部位分离的葡萄球菌耐药谱型检出结果
Table 4The main drug resistance phenotype of swine Staphylociccus isolates from different site

采集部位Samplesite耐药类型Drug-resistanttype耐药谱型Typeofdrugresistance株数Strains比率Rate(%)鼻腔样N6TE-RP-DF-A/C-OX-CM1214.17TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM1214.17AMK-TE-RP-DF-A/C-OX-CM67.1直肠样A8AMK-TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM1320.68AMK-GEN-TE-FFC-DF-A/C-OX-CM1320.69AMK-TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM1422.2

3讨 论

3.1不同部位分离的葡萄球菌对被检抗菌药物耐药结果分析

不同部位猪源葡萄球菌对被检抗菌药物有不同程度的耐药，其中直肠分离的葡萄球菌的耐药问题最为严重，尤其对临床常用的抗菌药物，如直肠分离的葡萄球菌除对克林霉素外8种抗菌药物的耐药率均高于鼻腔分离的葡萄球菌耐药率。直肠分离的葡萄球菌对阿米卡星、氧氟沙星和克林霉素3种抗菌药物高度耐药；鼻腔分离的葡萄球菌对氧氟沙星和克林霉素高度耐药。值得注意的是，直肠分离的葡萄球菌对除庆大霉素外，其余8种抗菌药物的耐药率均高达50%以上。试验的结果与高璐琰等调查结果[11]相比，动物摄入的抗菌药中有很大一部分通过动物的粪尿排泄。大部分抗菌药物在动物体内残留很少，其中约30%～90%的兽药以原药的形式排泄，其余以代谢物的形式排泄。由此证明了此次结果：肛拭子葡萄球菌的耐药率比鼻拭子葡萄球菌耐药率高。如果这部分抗菌药物及其代谢物有可能在动物排泄物排放及农用过程中进入环境，污染环境，那么进入生态环境的抗菌药物及其代谢物再次感染动物鼻腔，使其鼻腔的耐药率也增加。这点也符合研究的数据：不同部位分离的葡萄球菌耐药率都比较高的现象。

3.2不同部位分离的猪源葡萄球菌多药耐药差异性分析

经多重耐药分析发现，鼻腔分离的葡萄球菌主要以6耐和7耐为主；直肠分离的葡萄球菌以8耐和9耐为主。直肠分离的葡萄球菌在8耐和9耐显著高于鼻腔分离的葡萄球菌的多药耐药率(P<0.05)。直肠分离的葡萄球菌对9种被检抗菌药物都耐药的菌株是14株，占3.5%。直肠分离的葡萄球菌多药耐药情况比鼻腔分离的葡萄球菌多药耐药严重。多药耐药结果与葡萄球菌的耐药率结果相比，都说明直肠分离的葡萄球菌耐药情况严重于鼻腔分离的葡萄球菌耐药情况。正如上所述大部分抗菌药物是以原药或者其代谢物的形式排出动物体内，排泄物进入生态环境，污染周围环境，又再次通过各种途径进入肠道，无论是环境中污染/自然界存在的葡萄球菌还是由于使用抗菌药物而产生的耐药葡萄球菌都会再次通过肠道排泄。这样使得呼吸道与肠道相互交叉污染，更是加重了肠道的污染。那么直肠分离的葡萄球菌多药耐药比鼻腔分离的葡萄球菌多药耐药严重也被证实。

3.3不同部位分离的猪源葡萄球菌与国内其他动物源性葡萄球菌耐药性比较

国内大部分地区葡萄球菌对抗菌药物的耐药情况比较严重。耐药情况最为严重的为河南[4]地区，其对庆大霉素、四环素、氧氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、氟苯尼考和林克林霉素6种抗菌药物的耐药率集中在99.2%～100%；其次为广东[8]地区，主要在75%～100%；比较严重的是广州[5]地区，耐药率在40.0%～100%；耐药情况最轻的是宁夏[7]地区，耐药率主要在15.45%～40.45%；鼻腔分离的葡萄球菌耐药率在18.5%～89.5%；直肠分离的葡萄球菌耐药率在36.0%～84.5%。此研究与我国其他地区葡萄球菌耐药情况相比，直肠分离的葡萄球菌比鼻腔分离的葡萄球菌耐药问题更严重。全国范围内葡萄球菌对抗菌药耐药问题十分严重的主要原因是在生产当中用药不规范、疗程不当、用量不足，长期使用同一类药物或长期在饲料、饮水中加入预防性用药，均可使细菌产生抗药性[12]。

3.4产生耐药的原因

随着抗菌药物的大量广泛使用，使得耐药菌株不断增加。很多细菌对药物由敏感变为耐药，或由低水平耐药转变为高水平耐药，由单一耐药发展到多重耐药[13]。试验的比较说明，不同地区，不同动物源菌株耐药性虽存在一定的差异性，但是对于临床常用药物，庆大霉素、四环素、氟苯尼考、苯唑西林和克林霉素来自不同背景的结果，均表现较高的耐药性。

4结 论

该养猪场直肠分离的葡萄球菌对阿米卡星、庆大霉素、四环素、氟苯尼考、利福平和阿莫西林/克拉维酸6种抗菌药物的耐药率均比鼻腔分离的葡萄球菌的耐药率高27.7%、17.5%、9.5%、5%、11.5%和17.5%。直肠分离的葡萄球菌8耐和9耐的多药耐药率比鼻腔分离的葡萄球菌多药耐药率高8%和2.75%。总之，直肠分离的葡萄球菌耐药情况比鼻腔分离的葡萄球菌耐药情况严重。

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Analysis of Drug-resistance ofStaphylociccusIsolated from Pigs at Different Sites

CAI Jian-xing, XUAN Hui-yong, XIA Li-ning

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052，China)

Abstract：【Objective】 In order to investigate commonly used antimicrobial drug-resistance of Staphylociccus isolated from pigs at different sites (nasal and anal) in a farm in Changji, Xinjiang.【Method】 The minimal inhibitory concentrations (MIC) of the nine antimicrobial drugs to Staphylociccus were isolated from pigs at different sites. The broth dilution method was used to detect nine antibacterials' resistance of Staphylociccus and difference of drug-resistance rate was analyzed by SPSS. 【Result】 Results showed that the main resistance of Staphylococcus isolates from nasal rates to levofloxacin and clindamycin were 89.5%, 89%. The main resistance of Staphylococcus isolates from anal rates to clindamycin (84.5%), levofloxacin (81%) and amikacin (81.0%) were high. Through the chi square test analysis found that the resistance rates of Staphylococcus isolates from anal to amikacin and gentamicin were significantly higher than the isolated Staphylococcus isolates from nasal swabs (P<0.05). The drug resistance rate of Staphylococcus isolated from the nasal cavity was significantly higher than that of Staphylococcus (P<0.05). Multi drug resistance results displayed that the Staphylococcus isolated from the nasal cavity was 6 (11.75%), and the rectal isolates were 8 (11.5%). And in the 8 and 9 resistance, the resistance rate of Staphylococcus isolated from the nasal was significantly higher than that of the isolated from anal Staphylococcus isolated from anal swabs (P<0.05).【Conclusion】 The resistance rate of Staphylococcus isolated from the anal to most of the antimicrobial agents was higher than that of Staphylococcus isolated from the nasal. The multi drug resistance results described that the resistance rate of Staphylococcus isolated from the anal was more serious than that of the Staphylococcus isolated from the nasal. The drug resistance rate is more serious in the two kinds of different infection ways of respiratory tract and intestinal tract, and can be combined with different infection sites in clinical medicine, and scientific replacement of antimicrobial agents.

Key words:pig; different sites; Staphylococcus; antibacterial; resistance rate

中图分类号：S855

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)03-0563-06

作者简介:蔡建星(1991-)，女，新疆人，硕士研究生，研究方向为兽医药理与毒理学，(E-mail)cjx609231608@163.com通讯作者:夏利宁(1975-)，女，湖南宁乡人，副教授，博士，硕士生导师，研究方向为兽医药理与毒理学，(E-mail)xln750530@163.com

基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2014211A030)

收稿日期：2015-10-14

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.03.024

Fund project:Supported by the Natural Science Fund Projects of Science and Technology Department of Xinjiang Uygur Autonomous Region(2014211A030)