金羊平 吴皓 郁红礼 潘耀宗 陈叶青 王奎龙 张程超 王卫

[摘要]为探索姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激性毒性的机制，该研究采用掌叶半夏毒针晶诱导的小鼠腹腔炎症模型，观察姜辣素对小鼠腹腔炎症渗出液中炎症介质PGE2的影响；采用大鼠腹腔巨噬细胞体外培养模型，以上清液中TNFα和IL1β为指标，研究姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶的致炎作用；采用扫描电镜法观察姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激后巨噬细胞表面形态的改变；采用巨噬细胞中性粒细胞共培养模型，考察姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶对中性粒细胞迁移的影响。结果显示，姜辣素可以显著抑制掌叶半夏毒针晶所致的小鼠腹腔渗出液中PGE2的生成；姜辣素可以显著抑制掌叶半夏毒针晶诱导巨噬细胞释放炎症因子，并具有一定的量效关系；扫描电镜显示，姜辣素可以显著抑制巨噬细胞吞噬掌叶半夏毒针晶及细胞膜破损，并能显著抑制掌叶半夏毒针晶诱导的中性粒细胞迁移。姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激性毒性的机制可能是抑制了包括巨噬细胞激活、炎症因子释放、中性粒细胞迁移聚集的致炎毒性。

[关键词]姜辣素； 掌叶半夏； 巨噬细胞； 炎症因子； 扫描电镜； 中性粒细胞趋化

掌叶半夏，又名虎掌南星，为天南星科植物掌叶半夏Pinellia pedatisecta Schott的干燥块茎，最早记载于《神农本草经》[1]，为天南星科有毒中药且毒性最强，对口腔、咽喉等具有强烈的刺激性[2]。

本课题组前期研究证实，掌叶半夏刺激性毒性成分主要是蛋白和草酸钙结合形成的针晶复合物，被称为“毒针晶”[3]，电镜下毒针晶极细长、两头尖锐、质坚韧，具倒刺、凹槽[4]。毒理研究显示，掌叶半夏的毒针晶在机体表现为刺激性炎性反应。误食后在口腔咀嚼或吞咽的作用力下，大量毒针晶可刺入口腔及咽喉的黏膜组织，毒针晶刺入的同时针晶上的毒蛋白进入组织细胞诱发急性炎症，故掌叶半夏的刺激性毒性是毒针晶刺入的机械刺激和毒蛋白化学刺激的双重作用[56]。

生姜是姜科植物姜Zingiber officinale Rosc的根茎。生姜味辛，性温；归肺、胃、脾经；功效为发散风寒、温中止呕、化痰解毒，民间多用于解药物和食物中毒。生姜及生姜提取物具有广泛的药理作用，包括调节免疫、抗炎、镇痛、抗肿瘤、止呕等药理作用。生姜的块茎中含有多种化学成分，主要包括挥发油类、姜辣素、二苯基庚烷，其中姜辣素类成分是生姜抗炎的有效成分[7]。

课题组前期研究显示，掌叶半夏刺激性毒性与其刺激巨噬细胞相关[810]。炎症反应最重要的功能是将炎症细胞输送到炎症局部，白细胞的渗出是炎症反应最重要的特征，所以中性粒细胞迁移是炎症反应中至关重要的一步，起到主要的防御作用。故本文采用腹腔注射掌叶半夏毒针晶致小鼠腹腔炎症模型、大鼠腹腔巨噬细胞（MΦ）体外培养模型及体外中性粒细胞共迁移模型，深入研究姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶对巨噬细胞的致炎作用，为深入阐释生姜解掌叶半夏及整个天南星科有毒中药的毒性作用机制提供依据。

1材料

BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；LDZ2（Y）低速离心机（北京京立有限公司）；Spectra Max 190酶标仪（美国AD公司）；二氧化碳培养箱（美国NUAIRE公司）；LEICA MPS 60 DM显微镜系统（德国莱卡公司）； IB5离子溅射仪（日本日立公司）； SEM505扫描电子显微镜（荷兰飞利浦公司）。

胎牛血清（美国WISENT 公司）；RPMI 1640培养液（美国Hyclone公司）；trasnwell小室，48孔培养板（美国Corning公司）；DextranT500（葡聚糖）（美国Pharmacia公司），Percoll分离液；快速瑞姬氏染液（南京建成生物工程研究所）；TNFα，IL1β ELISA试剂盒（美国Ebioscience公司）；Mouse PGE2 ELISA试剂盒（南京翼飞雪生物科技有限公司）；台盼蓝（南京化学试剂有限公司）；非特异性酯酶染液（南京建成生物有限公司）；戊二醛（电镜级，美国Alfa公司）；乙醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；生理盐水（南京小营药业集团）；PBS缓冲液（实验室自制，高压蒸气灭菌）；羧甲基纤维素钠（化学纯，国药集团化学试剂有限公司），相关溶液均使用去离子水配制。

SD大鼠，SPF级，雄性，体重200～220 g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK（浙）20140001；ICR小鼠，清洁级，雄性，体重20～22 g，由扬州大学比较医学中心提供，许可证号SCXK（苏）20120004。

掌叶半夏采自河南省禹州市，药材经南京中医药大学王春根教授鉴定为天南星科植物掌叶半夏Ppedatisecta的块茎。生姜药材购自南京市农贸市场，经南京中医药大学刘训红教授鉴定为姜科植物姜的新鲜根茎。

2方法

21样品制备

211掌叶半夏毒针晶的分离纯化取鲜掌叶半夏适量，去皮切碎，置于研钵内，加入适量的有机溶剂，进行研磨，重复2～3次，将研磨提取的混悬液合并，先用4层医用纱布过滤，滤液再经过022 μm微孔滤膜抽滤，得到的白色滤饼即为掌叶半夏毒针晶[11]。

212生姜姜辣素的制备取鲜生姜适量，切碎，低温烘干，打成粗粉，用10倍量乙酸乙酯加热回流2 h，重复2次，回收溶剂，得到乙酸乙酯浸膏；水蒸气提取除去挥发油，得到姜辣素部位[12]，得率为09%。

以6姜酚为对照品，采用紫外分光光度法对生姜姜辣素部位中总姜辣素含量进行测定。结果显示，生姜姜辣素部位中总姜辣素质量分数为8928%。

22姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激性毒性作用研究

221姜辣素对掌叶半夏毒针晶致小鼠腹腔炎症渗出液中PGE2含量的影响取小鼠60只，随机分为6组，空白组、毒针晶组、阿司匹林组（25 g·kg-1）、姜辣素高剂量组（8 g·kg-1）、姜辣素中剂量组（4 g·kg-1）、姜辣素低剂量组（2 g·kg-1）。实验前1 d晚上禁食不禁水，实验时小鼠腹腔注射1 g·L-1掌叶半夏毒针晶生理盐水混悬液，空白组腹腔注射生理盐水001 mL·g-1。各组立即灌胃给予相应药物，姜辣素高、中、低剂量组分别灌以8，4，2 g·kg-1姜辣素05% CMCNa混悬液，空白组和毒针晶组均灌以05% CMCNa溶液，阿司匹林组灌以025 g·kg-1阿司匹林05% CMCNa混悬液，002 mL·g-1。1 h后处死，立即向每只小鼠腹腔注射生理盐水10 mL，轻揉腹部使之混匀。在5 min内取出小鼠腹腔内全部溶液置刻度离心管中，得到小鼠腹腔渗出液。取渗出液，按ELISA试剂盒方法测定前列腺素E2（PGE2）的含量[8]。

222巨噬细胞的提取分离纯化将健康大鼠脱颈椎处死，加入75%乙醇浸泡3 min后取出，腹腔注射20 mL PBS缓冲液，轻揉腹部5 min，使PBS缓冲液散布于整个腹腔，收集腹腔液，1 000 r·min-1离心5 min，得到富含巨噬细胞的沉淀。弃去上清，沉淀用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬并调节细胞密度至1×106个/mL，将此密度的细胞接种于细胞板中，37 ℃，5% CO2环境下培养2 h后，用PBS缓冲液洗去未贴壁的细胞，未被洗去的贴壁细胞即为所需的巨噬细胞，非特异性酯酶染色鉴定巨噬细胞纯度为99%；台盼蓝染色鉴定细胞存活率为99%[9]。

223人外周血中性粒细胞的分离纯化无菌采集健康志愿者的外周静脉血，加EDTAK2抗凝，取5 mL，加等量生理盐水稀释，再加1/3体积的6% T500，混合后静置30 min，吸取上清于1 500 r·min-1离心10 min， 弃去上清液，沉淀用1 mL RPMI 1640培养液重悬。100%的Percoll细胞分离液用无菌生理盐水分别配成75%，60% 2种不同密度的分离液，在离心管中依次加入75% Percoll，60% Percoll和细胞悬液，于2 500 r·min-1离心20 min，收集2层分离液中间的细胞层，并用PBS缓冲液清洗2遍，即得到纯化的中性粒细胞[9]。

224姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶诱导巨噬细胞释放炎症因子取222项下分离纯化的巨噬细胞用PBS缓冲液清洗数次，并加入新鲜配制的含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液。取适量掌叶半夏毒针晶于紫外灯下充分照射灭菌，用 PBS缓冲液配成针晶混悬液。将培养的巨噬细胞分成7组，每组设置3个复孔，其中6组给予半夏毒针晶混悬液，使终浓度为50 mg·L-1；空白组给予相同体积的PBS缓冲液，摇晃均匀后于37 ℃，5% CO2环境中孵育，10 min后其中2组给予阿司匹林溶液，使终浓度为25，50 mg·L-1；另外3组分别给予对应浓度的姜辣素溶液， 使终浓度为25，50，100 mg·L-1。孵育1 h后收集细胞上清液，上清液中炎症因子TNFα和IL1β的水平按照ELISA试剂盒说明书的方法分别进行检测[9]。

225姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶对巨噬细胞形态的影响大鼠腹腔巨噬细胞以1×106个/mL的密度接种于内置无菌盖破片的6孔细胞培养板中培养成血清饥饿状态。掌叶半夏毒针晶经紫外照射充分灭菌后，用PBS缓冲液配制成针晶混悬液。培养的巨噬细胞分为5组，每组设2个复孔。其中4组加入等体积的掌叶半夏毒针晶混悬液，使终浓度保持为50 mg·L-1，其中3组分别同时加入不同质量浓度的姜辣素溶液（25，50，100 mg·L-1）；空白组加入等体积的PBS缓冲液，放置于37 ℃，5% CO2环境中培养。培养1 h后中止培养，弃去培养液，用PBS缓冲液清洗，最后用25%戊二醛4 ℃固定过夜。载有固定好的巨噬细胞的盖玻片用30%，50%，70%，80%，90%，100%乙醇逐级脱水，喷金，并在扫描电镜下以6 000倍放大观察巨噬细胞的形态，并拍摄照片[9]。

226姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激巨噬细胞引起的中性粒细胞迁移本实验采用transwell小室模型，上室中加入RPMI 1640混匀的中性粒细胞悬液100 μL，密度为1×106个/mL，下室中分别为：①预培养的巨噬细胞+PBS缓冲液；②预培养的巨噬细胞+PBS缓冲液配制的掌叶半夏毒针晶混悬液，使其终浓度为50 mg·L-1；③预培养的巨噬细胞+掌叶半夏毒针晶混悬液（50 mg·L-1）+姜辣素溶液（25，50，100 mg·L-1）。

每组设置3个复孔。于37 ℃，5% CO2中培养1 h后，将小室取出，用棉签将小室上表面的残留细胞除去，并用快速瑞姬氏染色试剂盒对小室下表面细胞进行染色，于显微镜400倍镜下观察，并对穿过微孔膜的着色中性粒细胞进行计数[13]。

3结果

31姜辣素对掌叶半夏毒针晶致小鼠腹腔炎症渗出液中PGE2含量的影响

毒针晶组与空白组比较有显著性差异（P<00l），说明掌叶半夏毒针晶能造成小鼠腹腔炎症液中PGE2含量显著增高；而姜辣素组能显著地抑制掌叶半夏毒针晶所致的小鼠腹腔炎症渗出液中PGE2合成与释放，并呈一定的剂量依赖性（图1）。

与空白组比较1）P<001；与毒针晶组比较2）P<001（图2，4同）。

32姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶对巨噬细胞释放炎症因子的影响

姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶诱导巨噬细胞释放炎症因子，与掌叶半夏毒针晶模型组相比，不同质量浓度的姜辣素（25，50，100 mg·L-1）均能显著抑制巨噬细胞释放的炎症因子TNFα和IL1β的水平，并且这种抑制作用呈一定的量效相关（图2）。

33姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶对巨噬细胞形态的影响

与半夏毒针晶组相比，加入不同质量浓度的姜辣素（25，50，100 mg·L-1），可以不同程度的抑制巨噬细胞的皱缩、伪足增多、细胞膜破损，并且高浓度的姜辣素组可以使活化的巨噬细胞恢复至正常状态（图3）。结果表明，姜辣素能够抑制掌叶半夏毒针晶激活巨噬细胞吞噬异物的功能。

34姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激巨噬细胞对中性粒细胞趋化的影响

与毒针晶模型组相比，加入姜辣素（25，50，100 mg·L-1）组中性粒细胞迁移数量显著降低，这表明姜辣素抑制了掌叶半夏毒针晶刺激巨噬细胞引起的中性粒细胞迁移，并呈一定的剂量依赖性，此结果进一步证实了姜辣素可以显著抑制掌叶半夏毒针晶的致炎作用（图4）。

4讨论

本文实验结果表明，姜辣素灌胃给药能明显减轻掌叶半夏毒针晶所致的炎症反应，口服姜辣素能显著降低毒针晶所致小鼠腹腔炎症介质PGE2的生成，且这种拮抗作用呈剂量依赖性，说明生姜确实可以降低因服用掌叶半夏而导致的一些毒副作用。实验将阿司匹林作为阳性对照，结果阿司匹林也能明

显降低掌叶半夏毒针晶所致的炎症反应，表明阿司

匹林作为解热镇痛抗炎药具有确切的抗炎作用，也可进一步说明掌叶半夏毒针晶确实能导致刺激性炎症反应。

实验中各模型掌叶半夏毒针晶致炎剂量的确定，采用掌叶半夏毒针晶的量毒曲线和时毒曲线进行考察，结果小鼠腹膜炎模型选择01%掌叶半夏毒针晶剂量；参考中医临床生姜解半夏中毒的用量30 g，相当于小鼠灌胃剂量4 g·kg-1。从实验结果看，此剂量对掌叶半夏毒针晶引起的炎症反应均具有较好的抑制作用，能减少炎症介质的合成与释放，降低炎症组织水肿。

本文选择大鼠腹腔巨噬细胞体外培养、巨噬细胞中性粒细胞共培养2个模型，根据课题组前期研究结果选择掌叶半夏毒针晶50 mg·L-1作为致炎浓度，研究姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶的刺激性毒性机制。结果显示，姜辣素能够显著拮抗掌叶半夏毒针晶刺激巨噬细胞释放炎症因子；扫描电镜显示，姜辣素可以显著抑制巨噬细胞激活、伪足增多，细胞变形、细胞膜破损，说明姜辣素可以抑制巨噬细胞吞噬异物的功能；巨噬细胞中性粒细胞共培养实验表明，姜辣素能够抑制掌叶半夏毒针晶刺激巨噬细胞引起的中性粒细胞趋化，并呈一定的剂量依赖性。故姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激性毒性的机制可能是抑制了包括巨噬细胞激活、吞噬异物、炎症因子

释放、中性粒细胞迁移聚集，最终抑制了强烈的炎症反应的发生。

天南星科有毒中药半夏、掌叶半夏、天南星、白附子均含有毒针晶，本课题组研究发现，以上 4 种中药毒针晶是其共性毒性成分。本文从细胞分子水平上初步阐释了生姜解掌叶半夏毒的作用机制，为进一步揭示天南星科有毒中药的炮制解毒机制及安全性评价提供理论依据。

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[责任编辑马超一]