周良云 吕朝耕 康传志 王升 唐金富 康利平 郭兰萍

[摘要]为了考察黄花蒿在重金属镉胁迫下，是否存在相应的促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）基因参与镉信号的传导。该文通过对SRA数据库中的黄花蒿转录组进行拼接组装、BLAST以及对所得序列进行保守结构域分析，最终获得17条黄花蒿MAPK基因，命名为AaMAPK1～AaMAPK17。在这17个MAPK基因中，有16个含有T[D/E]Y保守结构域。实验利用Realtime PCR方法，分析了黄花蒿在重金属镉胁迫下17个MAPK基因的表达情况。结果显示AaMAPK3，AaMAPK10的表达下调，MAPK7，MAPK9，MAPK12的表达上调。这表明了黄花蒿中可能存在相应的MAPK基因参与了镉信号传导。

[关键词]黄花蒿；MAPK基因；镉胁迫；表达分析

促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）是丝/苏氨酸蛋白质激酶的一个大家族，广泛存在于真核生物中。MAPK级联途径包括3种蛋白激酶：MAPKKK，MAPKK，MAPK[1]。植物在响应外界的生物和非生物胁迫时，可以通过该级联途径将上游信号和下游的应答分子联系起来[2]。MAPKKK是位于级联途径上游的组件，通过信号分子的受体或其本身直接感受胞外刺激而被磷酸化激活。激活后的MAPKKK通过磷酸化MAPKK保守基序S/TX35S/T中的丝氨酸或丝氨酸/苏氨酸残基以激活MAPKK。MAPK是位于级联途径下游的组件，它含有一个非常保守的TXY（目前只发现TDY，TEY 2种）基序。MAPK的激活需要上游的MAPKK对它双重磷酸化，磷酸化位点是TXY基序中的酪氨酸和苏氨酸残基[2]。被激活的MAPK进入到细胞核内，再通过激活特定转录因子来调节功能基因的表达，或停留在细胞质中激活其它蛋白激酶，最终引起植物细胞响应内外刺激产生一系列生理生化反应[3]。随着人们对植物体MAPKs作用研究的深入，越来越多的数据显示MAPKs在植物信号传导过程中起着重要的作用。许多植物体内的MAPKs可以被生物因子（如微生物病原体感染）和非生物因子（如重金属、干旱、高盐、寒冷、过高或过低的渗透压）所激活[12]。

黄花蒿Artemisia annua L为菊科一年生植物，其地上部分即为我国传统中药青蒿，具有清虚热、凉血、截疟等功效[4]。现代药理研究表明，黄花蒿的抗疟活性成分为青蒿素。虽然青蒿素已可以人工合成，但由于成本高、毒性大而未能投产。目前，通过人工栽培从原植物黄花蒿中提取分离依然是青蒿素的主要商业来源。本实验室前期研究显示[56]，在不同浓度重金属镉胁迫黄花蒿的土壤栽培以及水溶液培养实验中均能观察到一定浓度的重金属镉显著提高了青蒿素的合成与积累。然而，关于黄花蒿通过什么途径将外界镉信号传递到胞内进而引起其次生代谢产物的合成发生变化依然未有相关报道。Liu等 [7]发现，拟南芥在镉胁迫下，MAPK3和MAPK6的基因被激活。然后当预先使用活性氧清除剂时，可有效地抑制MAPK3和MAPK6的活性。该结果表明，拟南芥在重金属镉胁迫下信号传导通路是镉ROSMAPK3/MAPK6。另外，在镉胁迫紫花苜蓿的研究中同样发现了MAPK级联途径参与镉信号的传导，其传导通路为镉SIMK/SAMK/MMK2/MMK3[8]。为了考察黄花蒿在重金属镉胁迫下，是否存在相应的MAPK基因参与镉信号的传导。本研究通过在水培液中添加不同浓度镉的方法胁迫处理黄花蒿，并于处理后不同时间收集叶片组织，对其MAPK基因进行差异表达分析，鉴定可能参与镉信号传导的MAPK基因。

1材料

实验所用黄花蒿A annua种子来源于西南濒危药材资源开发国家工程实验室桂蒿3号种子。播种前，将蛭石灭菌，分装于花盆中，每个花盆装蛭石至三分之二高度处，黄花蒿生长期间，每3 d浇1次营养液，每天浇1次蒸馏水，保持蛭石一定的含水量，待生长至5 cm左右高度，随机选取黄花蒿幼苗置于含1 L pH 58 Hoagland营养液的水培罐中培养，每罐3株，用洗净灭菌的海绵包住苗茎固定，2 d更换1次营养液。培养条件：温度 25 ℃；钠灯为光源，每天光照12 h。

水溶液培养黄花蒿40 d后，以Cd（NO3）2·4H2O的形式添加到营养液中继续培养，实验设定2个处理组：分别为20，80 μmol·L-1。以0 μmol·L-1为对照组，以1罐为1个重复，每个处理设6个重复。取样时间设定为0，4，8，12，24，48，60，72 h。样品用液氮速冻后，置于-80 ℃保存。

2方法

21数据下载NCBI的SRA（The Sequence Read Archive）数据库中存储了大量由二代测序平台包括Roche 454 GS System，Illumina Genome Analyzer，Applied Biosystems SOLiD System等测得的原始序列。SRA数据库收录了黄花蒿的成熟叶片腺毛、幼叶腺毛、子叶、分生组织以及花蕾腺毛5个组织的转录组序列，这5个转录组序列均由Roche 454 GS FLX平台测得。

22数据组装用SRA Toolkit （http：//eutilsncbinihgov/Traces/sra/？view=software）将从NCBI下载的SRA文件转成SFF格式文件，然后用454 Data Analysis Software package （http：//www454com/products/analysissoftware/）中的sffinfo （s参数）提取SFF文件中的序列信息得到FASTA格式的序列文件。用转录组拼接软件Trinity （http：//trinityrnaseqsourceforgenet）把5个库的FASTA序列文件进行拼接，使用参数seqType fa single CPU 8，从而把测序数据拼接成转录本序列。在拼接结果中，选最长的转录本序列作为该基因的代表转录本（Unigene）。

23AaMAPK家族基因的获取以拟南芥的MAPKs为query序列，1×10-6作为E Value的临界值，进行本地BLAST，所得序列进行保守域和Pfam分析，以获取黄花蒿的MAPKs基因。

24引物设计从Unigene中调出AaMAPKs基因序列，根据Realtime PCR引物设计需满足的条件通过Primer Premier 50软件设计特异性引物，并交由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

25总RNA的提取与实时荧光定量分析从-80 ℃冰箱取出试验材料，在EP管中加入磁珠，用球磨粉碎机粉碎。总RNA的提取参照QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit （cat nos 74903 and 74904）和RNaseFree DNase Set（cat no79254）说明操作。使用Takara公司的反转录试剂盒（PrimerScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit）进行反转录，生成单链cDNA。冰上配置反应体系为10 μL，包含5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix （Applied Biosystems，USA），1 μL cDNA，1 μL primers （上下游引物已混合，各引物的量约为25 mmol·L-1），ddH2O 3 μL，在ABI 7500定量分析仪上进行反应。PCR扩增条件为：酶活化（50 ℃，2 min）；预变性（95 ℃，10 min）；变性（95 ℃ 15 s），退火和延伸（60 ℃ 1 min）40个循环。最后添加溶解曲线设置。相对定量分析结果采用2-ΔΔCT法计算[9]。

26数据处理实验结果使用Excel 2007进行数据分析并绘图。

3结果

31数据组装对SRA库中的数据组装，组装结果共获得25 168条Contigs，其中长度大于1 000 bp的Contig共有3 292条，长度大于500 bp的Contig共有12 743条。组装后的Contig平均长度为627 bp，最长Contig为5 709 bp，其中N50为691 bp，N90为357 bp。

32AaMAPKs基因及其引物特异性检测通过Blast和结构域的分析，在黄花蒿Unigene数据中得到17条序列，其中有10个TEY类型的MAPKs基因，6个TDY类型的MAPKs基因，1个未知类型。根据搜索到的MAPKs基因序列设计并合成相关基因的特异性引物，结果见表1。各MAPKs基因命名先分TEY和TDY 2大类，再按得到的序列长短依次命名。实验结果显示所有引物的PCR产物熔解曲线均是单峰，表明引物特异性好。各引物的熔链温度（Tm）分别为：MAPK1 7908；MAPK2 7575；MAPK3 7723；MAPK4 763；MAPK5 7463；MAPK6 7445；MAPK7 7556；MAPK8 7815；MAPK9 7297；MAPK10 7519；MAPK11 7815；MAPK12 789；MAPK13 7878；MAPK14 7518；MAPK16 776；MAPK17 7815。

33AaMAPKs基因表达差异分析在黄花蒿Unigene中共搜索到17个MAPK基因，其中MAPK15在黄花蒿叶片中表达量较低，因此在本试验中没有检测其相对表达量。16个AaMAPKs基因相对表达量见图1。由图可见随着处理时间的延长，AaMAPK3，AaMAPK10 2个基因在对照组中的表达量始终高于20，80 μmol·L-1处理组，说明了黄花蒿在镉的诱导下AaMAPK3，AaMAPK10基因的表达水平受到了抑制。AaMAPK3，AaMAPK10均属于TEY类型基因。AaMAPK7，AaMAPK9，AaMAPK12在20，80 μmol·L-1处理组中的表达量均高于对照组且处理浓度越高表达量越高，说明镉对黄花蒿中AaMAPK7，AaMAPK9，AaMAPK12的表达表现出促进作用。其中AaMAPK7，AaMAPK9属于TEY类型，AaMAPK12属于TDY类型。随着处理时间的变化，AaMAPK6基因在对照组和各处理组中表达趋势基本一致，且相对于0 h表达量均较高。考虑到在取样过程中要剪取叶片，对植株造成了损伤，因此推测AaMAPK6基因的表达可能与机械损伤有关，说明机械损伤在一定程度上能够促进AaMAPK6的表达。通过结构域的分析AaMAPK6基因属于TEY类型。

4讨论

将黄花蒿SRA数据库中5个EST库进行组装得到了质量较高的黄花蒿Unigene，为搜索黄花蒿的AaMAPKs基因提供可靠的检索数据库。目前，已有许多植物MAPK基因被分离出来，其中拟南芥有20个[10]，水稻有17个[11]，玉米有19个[12]，烟草17个[13]，番茄16个[14]。本研究通过Blast和结构域的分析，在黄花蒿Unigene数据库中共检索到了17条序列。其中有10个TEY类型的MAPKs基因，6个TDY类型的MAPKs基因，1个未知类型。而在模式植物拟南芥中的20个MAPKs基因中，12个属于TEY类型，8个属于TDY类型[15]。这说明不同物种之间MAPK基因的数目和结构域分类不同，这些基因可能参与植物不同的生理活动。

实验通过对镉诱导下黄花蒿中MAPK基因的表达进行差异性分析，发现有2个MAPK基因（AaMAPK3和AaMAPK10）的表达量下调，3个MAPK基因（MAPK7，MAPK9，MAPK12）的表达量上调，这说明了黄花蒿中存在相应的MAPK基因参与了镉信号的传导作用。有趣的是，本研究中发现AaMAPK3，AaMAPK10 2个基因在重金属镉作用下表达量下降。然而到目前为止有关植物在重金属镉及其他外源物作用下，MAPK基因表达下调鲜有报道[16]。同时，表达下调的MAPK基因在植物信号传导过程中承担着何种作用仍然未知。另外，通过对实验数据的分析推测黄花蒿中存在一个MAPK基因对机械损伤有响应作用，并且在损伤下该基因的表达量升高。

[参考文献]

[1]Nakagami H， Pitzschke A， Hirt H. Emerging MAP kinase pathways in plant stress signalling[J]. Trends Plant Sci， 2005， 10（7）： 339.

[2]Opdenakker K， Remans T， Vangronsveld J， et al. Mitogenactivated protein （MAP） kinases in plant metal stress： regulation and responses in comparison to other biotic and abiotic stresses[J]. Int J Mol Sci， 2012， 13（6）： 7828.

[3]Jonak C， krész L， Bgre L， et al. Complexity， cross talk and integration of plant MAP kinase signalling[J]. Curr Opin Plant Biol， 2002， 5（5）： 415.

[4]中国药典. 一部[S]. 2010： 184.

[5]韩小丽， 黄璐琦， 郭兰萍， 等. 土壤青蒿系统中镉 （Cd） 迁移规律及 Cd 对青蒿生长和青蒿素含量的影响[J]. 中国中药杂志， 2010，35（13）： 1655.

[6]Li X， Zhao M， Guo L， et al. Effect of cadmium on photosynthetic pigments， lipid peroxidation， antioxidants， and artemisinin in hydroponically grown Artemisia annua[J]. J Environ SciChina， 2012， 24（8）： 1511.

[7]Liu X M， Kim K E， Kim K C， et al. Cadmium activates Arabidopsis MPK3 and MPK6 via accumulation of reactive oxygen species[J]. Phytochemistry， 2010， 71（5）： 614.

[8]Jonak C， Nakagami H， Hirt H. Heavy metal stress. Activation of distinct mitogenactivated protein kinase pathways by copper and cadmium[J]. Plant Physiol， 2004， 136（2）： 3276.

[9]Schmittgen T D， Livak K J. Analyzing realtime PCR data by the comparative CT method[J]. Nat Protoc， 2008， 3（6）： 1101.

[10]Mizoguchi T， Hayashida N， YamaguchiShinozaki K， et al. ATMPKs： a gene family of plant MAP kinases in Arabidopsis thaliana[J]. FEBS Lett， 1993， 336（3）： 440.

[11]Lieberherr D， Thao N P， Nakashima A， et al. A sphingolipid elicitorinducible mitogenactivated protein kinase is regulated by the small GTPase OsRac1 and heterotrimeric Gprotein in rice[J]. Plant Physiol， 2005， 138（3）： 1644.

[12]Lalle M， Visconti S， Marra M， et al. ZmMPK6， a novel maize MAP kinase that interacts with 1433 proteins[J]. Plant Mol Biol， 2005， 59（5）： 713.

[13]Wilson C， Anglmayer R， Vicente O， et al. Molecular cloning， functional expression in Escherichia coli， and characterization of multiple mitogenactivatedprotein kinases from tobacco[J]. Eur J Biochem， 1995， 233（1）： 249.

[14]Kong F， Wang J， Cheng L， et al. Genomewide analysis of the mitogenactivated protein kinase gene family in Solanum lycopersicum[J]. Gene， 2012， 499（1）： 108.

[15]Ichimura K， Shinozaki K， Tena G， et al. Mitogenactivated protein kinase cascades in plants： a new nomenclature[J]. Trends Plant Sci， 2002， 7（7）： 301.

[16]于莹， 陈宏宇， 程莉莉， 等. 亚麻MAPK 基因克隆及盐碱胁迫下的表达分析[J]. 东北农业大学学报， 2015（3）： 4.

[责任编辑吕冬梅]