江君丽，任娟娟，唐春春，张超，朱宇航，朱昭琼

(1贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州遵义563000；2遵义医学院附属医院)

·基础研究·

新生期大鼠重复吸入七氟醚对其幼年及成年学习、记忆能力及脑脊液中ApoE浓度的影响

江君丽1，任娟娟1，唐春春1，张超1，朱宇航2，朱昭琼1

(1贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州遵义563000；2遵义医学院附属医院)

目的 观察新生期大鼠重复吸入七氟醚对其幼年及成年学习、记忆能力及脑脊液中载脂蛋白E(ApoE)浓度的影响，探讨七氟醚重复吸入麻醉的安全性。方法 将新生SD大鼠32只随机分为四组，七氟醚幼年组、七氟醚成年组及对照幼年组、对照成年组。七氟醚幼年组及成年组均于出生第7、14、21天吸入2.6%七氟醚2 h，对照幼年组及成年组同时间点吸入对照运载气体2 h。幼年期大鼠于出生第31天、成年期大鼠于出生第91天行Morris水迷宫实验。所有大鼠于水迷宫实验结束后立即取脑脊液，ELISA法检测ApoE。结果 水迷宫实验适应性训练期间，各组均会游泳，未发现眼盲、智力障碍大鼠；定位航行能力测试过程中，随着训练次数的增加，各组逃避潜伏期均逐渐缩短，七氟醚幼年组与对照幼年组、七氟醚成年组与对照成年组逃避潜伏期比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；在空间探索试验过程中，七氟醚幼年组和对照幼年组、七氟醚成年组和对照成年组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。七氟醚幼年组与对照幼年组脑脊液ApoE浓度分别为(35.45±10.60)、(33.24±8.71)ng/mL，两组比较P>0.05；七氟醚成年组与对照成年组脑脊液ApoE浓度分别为(31.82±4.70)、(15.34±4.71)ng/mL，两组比较P>0.05。结论 新生期大鼠重复吸入七氟醚对其幼年及成年学习、记忆能力无明显影响，对脑脊液中ApoE浓度亦无明显影响，提示七氟醚重复吸入麻醉安全。

七氟醚；学习；记忆；行为学；载脂蛋白E；脑脊液

七氟醚为临床普遍应用的新型吸入麻醉剂，具有诱导时间短、对呼吸系统及心血管系统影响小、停药后苏醒迅速等优点。但有研究认为七氟醚会对婴幼儿大脑造成一定的影响[1,2]。婴幼儿时期是大脑发育的突触塑形期，在这一时期重复吸入七氟醚是否会对其远期的学习和记忆产生影响是人们普遍关注的问题。载脂蛋白E(ApoE)对神经系统的生长及修复起重要作用。2014年3月～2015年5月，本研究观察了新生期大鼠重复吸入七氟醚对其远期学习、记忆能力及脑脊液中ApoE浓度的影响，探讨七氟醚重复吸入麻醉的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料 SD孕鼠5只，由第三军医大学实验动物中心提供(动物许可证号：SCXK渝2012-0005)。孕鼠在SPF级动物房饲养自行产仔，获得新生SD大鼠32只。七氟醚(益君宁)，鲁南贝特制药有限公司；钠石灰，英国Intersurgical公司。ApoE ELISA试剂盒，美国MyBioSource公司。Morris水迷宫测试仪，成都泰盟科技有限公司；Drager Julian麻醉机、气体监测仪，上海德尔格医疗设备有限公司；自制吸入麻醉箱。

1.2 动物分组及处理 采用随机数字表法将32只新生SD大鼠分为七氟醚幼年组、七氟醚成年组、对照幼年组和对照成年组，每组8只。七氟醚幼年及成年组于出生第7、14、21天置入自制吸入麻醉箱中行吸入麻醉，通过调节Drager Julian 麻醉机使七氟醚浓度维持于2.6%，每次吸入时间为2 h。每次麻醉前在麻醉箱底部放置适量钠石灰以吸收CO2，并在麻醉箱底铺上保温毯维持箱温于28～32 ℃。麻醉期间严密观察大鼠呼吸、皮肤色泽，防止大鼠缺氧窒息。麻醉结束后关闭挥发罐，将大鼠取出放置于自然环境中，待所有大鼠苏醒后送回动物房与母鼠一同喂养。对照幼年组和成年组分别于出生7、14、21天置于自制吸入麻醉箱中吸入对照运载气体(1 L/min O2+1 L/min 空气)，每次时长2 h，吸入结束后送回动物房与母鼠一同喂养。

1.3 学习和记忆能力测试 七氟醚幼年组及对照幼年组于出生第31天、七氟醚成年组及对照成年组于出生第91天开始行Morris水迷宫实验。①适应性训练：各组幼年大鼠于出生第31天、成年大鼠于出生第91天进行为期1天的适应性训练。将大鼠随机放置于水池的任一位置，使其游泳2 min，淘汰不会游泳者。②定位航行试验：幼年组于出生第32～35天、成年组于出生第92～95天进行定位航行试验。大鼠从某一固定点面向池壁入水，让其寻找并爬上距水面1.5 cm的隐藏平台(平台随机放置于水池的任一象限)。如120 s内未爬上平台，则指引其爬上平台并休息10 s，记录训练第1～4天的逃避潜伏期(即大鼠找到平台所需的时间)。每天训练4次，取平均值。③空间探索试验：各组幼年大鼠于出生第36天、成年大鼠于出生第96天进行空间探索试验。撤去平台，大鼠自与平台象限相对的象限入水，游泳120 s。记录大鼠穿越平台象限的次数、通过每个象限的次数、通过平台象限的频率，记录有效区域(原平台区域的1.5倍范围)运动时间、有效区域运动距离、有效区域进入次数以及平台象限滞留时间百分比、平台象限运动距离百分比、平台象限进入次数百分比。

1.4 脑脊液ApoE浓度检测 空间探索试验完成后各组均立即取脑脊液置于-80 ℃冰箱中冷冻保存。采用ELISA法检测ApoE浓度。一抗为生物素化的抗大鼠ApoE抗体，二抗为辣根过氧化物酶标

抗体。操作过程包括加样、加生物素化抗体工作液、洗板、加辣根过氧化物酶标抗体工作液、洗板、加底物工作液、终止。用酶标仪在波长450 nm处检测光密度值(OD值)，根据OD值绘制ApoE质量浓度曲线，计算ApoE浓度。

2 结果

2.1 学习和记忆能力 适应性训练期间，各组均会游泳，未发现眼盲、智力障碍大鼠。在定位航行试验中，相同时间点七氟醚幼年组与对照幼年组、七氟醚成年组与对照成年组逃避潜伏期比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。在空间探索试验中，七氟醚幼年组与对照幼年组、七氟醚成年组与对照成年组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

表1 各组定位航行试验中逃避潜伏期比较±s)

表2 各组空间探索试验结果比较±s)

2.2 脑脊液ApoE浓度 七氟醚幼年组及对照幼年组脑脊液ApoE浓度分别为(35.45±10.60)(33.24±8.71)ng/mL，两组比较P>0.05；七氟醚成年组及对照成年组脑脊液ApoE浓度分别为(31.82±4.70)、(15.34±4.71)ng/mL，两组比较P>0.05。

3 讨论

新生期是学习与记忆形成的关键时期，在这一时期中枢神经系统存在许多突触的形成与反射的建立；此期如有不良因素刺激可影响认知功能的发展[3,4]。谢娟等[5]研究认为，吸入2%或4%七氟醚均会引起大鼠认知功能下降，且随浓度的增加其对认知功能的影响显著增强；朱霞等[1]认为，七氟醚影响认知功能的效应是短期的、一过性的。但上述研究均为单次吸入七氟醚，重复吸入七氟醚对远期学习、记忆的影响未见报道。

临床常用的七氟醚浓度为2%～3%，新生大鼠七氟醚最低肺泡有效浓度(MAC)约为2%，临床99%有效剂量(ED99)值为1.3 MAC，即2.6%[6]，故本实验七氟醚吸入浓度定为2.6%。Morris水迷宫实验受外界因素影响较小，能较好地评价大鼠的认知功能；其中定位航行试验检测大鼠在多次训练后，找到隐藏在水中的固定平台，形成稳定的空间位置认知，这种空间认知是通过加工空间信息形成的，所形成的记忆属于空间参考记忆，按信息加工和提取的方式来看，这种空间参照记忆又属于陈述性记忆；空间探索试验是对定位航行中形成的记忆信息提取的过程，检测的是空间联想和回忆探究能力，属于认知功能中的联合型学习能力[7]。本研究定位航行试验中，随着训练次数的增加，各组逃避潜伏期均逐渐缩短，说明大鼠通过训练均可逐步形成稳定的空间参照记忆。七氟醚幼年组与对照幼年组、七氟醚成年组与对照成年组逃避潜伏期比较差异均无统计学意义，与谢娟等[5]研究结果一致，他们认为出生第36天已处于认知功能损害的修复阶段，此时大鼠的学习、记忆功能已大部分恢复。认知功能包括知觉、注意、表象、记忆、学习、思维和语言等多个方面，本研究仅从学习与记忆方面分析了七氟醚对认知功能的影响，目前的结果仅表明新生期重复吸入七氟醚不会对幼年期和成年期陈述性记忆的形成及联合型学习能力产生明显影响，七氟醚对认知功能其他方面的影响还不明确。

ApoE是一种相对分子量为34 145 D的血浆蛋白，主要在肝脏内合成，亦可在脑组织中表达，星形胶质细胞是其主要合成部位。ApoE参与中枢神经系统的发育、功能维护和损伤后修复等过程[8]。ApoE有三种亚型，包括ApoE2、ApoE3和ApoE4。在神经元的生长过程中ApoE具有亚型特异性[9]，ApoE4与微管蛋白的解聚有关，可抑制神经元的生长；ApoE3可增加tau蛋白的稳定性，促进神经元的生长[9]。有研究表明，脑脊液中ApoE与大脑中的脂质代谢和中枢神经系统疾病的病理学发展联系密切[10]。秦斌等[11]发现，阿尔茨海默(AD)患者脑脊液ApoE浓度明显高于其他神经系统疾病患者，说明ApoE大量存在于AD患者脑内。研究发现，脑内ApoE升高可能与老年斑、神经纤维缠结形成和脑血管淀粉样变性增多有关，机制可能为ApoE促进β-淀粉样肽(Aβ)的沉积，从而引起神经变性和行为缺陷[12～14]。朱宇航等[15]研究提示，七氟醚诱导的认知功能障碍与其上调海马ApoE mRNA无关。分析本研究结果，尚不能认为新生期重复吸入七氟醚会对幼年期及成年期大鼠脑脊液中ApoE浓度产生影响。可能原因有: ①七氟醚麻醉所引起的脑脊液ApoE浓度的变化具有亚型特异性，如ApoE4升高而ApoE3降低，从而表现为总体变化不明显[14]；②七氟醚所引起的术后认知功能障碍并非仅通过ApoE这一通路[15]。

综上所述，新生期重复吸入七氟醚对大鼠近期及远期学习、记忆能力无明显影响，对脑脊液中ApoE浓度亦无明显影响，说明七氟醚重复吸入麻醉安全；但其对认知功能其他方面的影响及对ApoE各亚型的影响仍需进一步研究。

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国家自然科学基金资助项目(81360180)。

朱昭琼(E-mail: 314887347@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.008

R971

A

1002-266X(2016)28-0026-03

2015-10-28)