杨雨琨，唐　洁（.湖北省大冶市第一中学，湖北大冶43500；.劲牌有限公司，湖北大冶43500）



一株米根霉固态发酵代谢产物的分析

杨雨琨1，唐洁2
（1.湖北省大冶市第一中学，湖北大冶435100；2.劲牌有限公司，湖北大冶435100）

摘要：分析1株来源于小曲白酒中米根霉G12固态发酵的代谢产物。通过在实验室模拟小曲白酒固态发酵工艺建立小试发酵平台，添加纯种米根霉作为酒曲，经糖化、发酵、蒸馏，测定馏液中主要挥发性成分，对照组为不添加任何酒曲。结果表明，米根霉G12具有较强的产酒能力，产酒平均出酒率为12.10 %。同时该株菌在固态发酵中也能产生大量正丙醇与杂醇油，因而对杂醇油的生成有一定的贡献。研究可为降低小曲白酒杂醇油途径提供不同的思路。

关键词：米根霉；固态发酵；产物分析；白酒

清香型小曲白酒的工艺特点是先糖化，后发酵，清蒸流酒，续米查配料。小曲酒酿造工艺流程为：原料→泡粮→蒸粮(装甑、初蒸、闷水、复蒸)→培菌(出甑摊晾、翻粮、加曲、进箱保温)→发酵(配糟、出箱、摊晾、混合、入池)→蒸馏[1]。独特的酿造工艺，造就了小曲清香型白酒具有以乙酸乙酯为主体的协调复合香气，清香纯正、入口微甜、香味悠长、落口干爽、微有苦味等特点。乙酸乙酯、乳酸乙酯、高级醇是构成清香型小曲酒的主体香味成分，且组分中具有酯低、酸高、高级醇高等特征[2]。但与大曲清香白酒相比，小曲清香型白酒特点是口味简单、出酒率高，酒的品质和口感不如大曲酒丰富。

清香型小曲白酒发酵过程中酵母主要起产酒精和代谢风味物质作用，杂醇油是其代谢副产物。米根霉在酿酒过程中产生糖化酶及液化酶，可将原料中的淀粉转化成酵母可以利用的糖类物质，主要起糖化作用[3]。另外，有文献报道米根霉还有一定的产酒精的作用，在发酵过程中，还可产生一些风味物质，但没有具体的数据表明。开展本试验的目的就是考察米根霉的产酒能力，以及其对小曲白酒固态发酵中主要微量成分如乙酸乙酯、杂醇油的生成是否有贡献。

1　材料与方法

1.1材料

实验菌株：分离于小曲白酒酒曲，经纯化、麸皮管保藏的菌种米根霉G12，作为实验菌种；高粱为东北高粱。

主要试剂：葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉为生化级试剂，氯化钠为分析试剂。

主要仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、Agilent 7890A型气相色谱仪（配有氢火焰检测器和7863型自动进样器，美国安捷伦公司产品）。

YPD琼脂培养基：酵母提取物1 %，葡萄糖2 %，蛋白胨2 %，琼脂粉2 %，121℃灭菌20 min。

1.2实验方法

本研究模拟酿造车间生产工艺流程进行，即蒸粮、糖化培菌、入瓶发酵和蒸馏。为避免发酵过程中其他微生物生长影响实验结果，蒸粮后摊晾及后续操作均在无菌室中进行。试验分成两组进行，设置实验组和空白组：实验组加入纯种根霉曲，空白组不添加任何酒曲。

1.2.1蒸粮

蒸粮的目的在于使淀粉颗粒吸水、膨胀、破裂、糊化，以利于淀粉酶的作用和后续糖化及发酵过程在微生物的利用；同时，在高温下，粮食也得以灭菌，并排除一些挥发性的不良成分。

在三角瓶中称取250 g东北高粱，自来水浸泡24 h后，沥干水分，经过初蒸（121℃，20 min）、闷粮（100℃，25 min）和复蒸（115℃，10 min），使粮食水分在53 %～60 %，感官上达到大部分开口，软硬适中。复蒸时，纱布包扎瓶口，避免杂菌进入。

1.2.2糖化培菌

糖化过程包括淀粉经酶作用生产糖和酒曲中微生物利用糖增殖两个过程。为确保糖化过程中产香正常，小试试验中熟粮糖化培菌在恒温培养箱中进行，控制培养温度为30℃。

熟粮在无菌室内摊晾后，按1 %的加曲量，分别称取2.5 g纯种根霉曲加入实验组，混合均匀，在培养箱中30℃糖化24 h。空白组为不添加酒曲的熟粮直接放入培养箱。

1.2.3入瓶发酵

糖化醅与配糟按一定比例混匀后入容器，在酵母、霉菌、细菌等微生物作用下产生乙醇、酸、酯及其他各种成分的过程即为发酵。

配糟采用大试车间复原糟，干糟与水按3∶7比例混合，浸泡3 h，121℃灭菌20 min。灭完菌后，复原糟水分控制在70 %～72 %。糖化醅与配糟按1∶1的重量比例混合入瓶，塞上装有2.5 mol硫酸的发酵栓，在培养箱中30℃发酵7 d。

1.2.4蒸馏

发酵结束后，取1000 g发酵酒醅，利用小型蒸馏器蒸馏，接取溜出液50 mL。

1.2.5酵母计数

为防止发酵过程中污染酵母影响米根霉代谢产物的分析，对发酵结束后酒醅样品进行酵母计数。取发酵结束后的酒醅，称10 g样品于100 mL无菌生理盐水中，150 r/min振荡30 min，在无菌操作台上吸取200 μL菌悬液，均匀涂布在YPD平板上，30℃培养2～3 d后计数。平板计数以30～300个菌落数为有效数值。

1.2.6气相色谱检测

溜出液利用气相色谱仪检测微量成分组成及含量，具体方法见文献[4]。

2　结果与分析

2.1酵母计数

培养3 d后，各酒醅样品中酵母计数结果见表1。实验组和空白组在发酵过程中均有样品出现酵母感染的现象，尤以实验组1和空白组8感染酵母较多，不可计数。这很可能与糖化时放在恒温培养箱中开放式培菌有关，也与发酵器皿未洗干净、酒精消毒未彻底有关。但实验组2—6，空白组7未受酵母污染，具有实验意义。

表1 发酵结束时酒醅中酵母在YPD平板上数量

2.2色谱数据分析

2.2.1米根霉G12产酒精能力分析

将发酵结束蒸馏得出的馏液进行酒精度检测，折算成55 %vol出酒率情况见表2。实验组1酒精度和出酒率都比其他组高，这与该实验组污染大量酵母有关。实验组2—6酒精度和出酒率相差不大，平均出酒率为12.01 %。空白组理论酒精度和出酒率应该为0 %，由于空白组8感染酵母原因，导致酒精度和出酒率比理论值高。由此可以判断，米根霉G12不仅具有糖化功能，还有一定的产酒精能力，与文献报道相吻合。

表2 各酒醅样品酒精度及折55 %vol出酒率情况

2.2.2米根霉G12产酯、产杂醇油能力分析

清香型小曲白酒主体香味成分为乙酸乙酯，由表3可知，米根霉G12代谢产乙酸乙酯能力非常弱，平均为5.84 mg/100 mL，说明该菌株对小曲白酒酯香无贡献作用；该菌株代谢生成正丙醇平均值为39.19 mg/100 mL、杂醇油平均值为97.99 mg/100 mL，空白值为0，说明该菌株具有较强的产正丙醇和杂醇油能力。传统观点认为，正丙醇和杂醇油均是酵母代谢产酒精的副产物，其中降低杂醇油含量方法之一就是选育低产杂醇油的酵母菌株。本试验发现米根霉也具有产杂醇油的能力，说明其对小曲白酒中杂醇油的生成有一定的贡献作用。

表3 各酒醅样品代谢产酯及杂醇油情况

3　结论

研究了纯种根霉曲以高粱为原料在实验室进行小试固态发酵，对发酵结束后蒸馏得出的馏液进行分析，得出米根霉G12具有较强的产酒能力，产酒平均出酒率为12.10 %。同时根霉G12在固态发酵中也能产生大量正丙醇与杂醇油，因而对小曲白酒中杂醇油的生成有一定的促进作用。说明杂醇油的生成菌株不一定全是酵母，可以拓宽思路为降低小曲白酒中杂醇油途径提供不同的方法。

参考文献：

[1]李锐利.高产乙酸乙酯酵母的选育及在清香型小曲酒中的应用研究[D].武汉：湖北工业大学, 2011.

[2]杨强,王衍,童国强.清香型小曲酒的香味组分特点及风味特征[J].酿酒科技, 2001(2)：75-76.

[3]冯春，汪光明，杨强,等.绿衣观音土曲中微生物种群区系分析及其功能研究[J].酿酒科技,2005,129(3)：39-42.

[4]王海瑞，陈军.气相色谱内标法测定白酒中高级醇与酯类[J].农产品加工（学刊）,2014,361(8)：54-56.

Analysis of the Metabolites of a Rhizopus oryzae Strain in Solid-State Fermentation

YANG Yukun1and TANG Jie2
（1.No.1 Middle School of Daye, Daye, Hubei, 435100；2.Jingpai Co. Ltd., Daye, Hubei 435100, China）

Abstract：To analyze the metabolites of the Rhizopus oryzae strain G12(isolated from Xiaoqu Baijiu) in solid-state fermentation, we simulated the solid-state fermentation techniques of Xiaoqu Baijiu and built a small-scale testing platform in the laboratory. With purebred Rhizopus oryzae as starter, we measured the main volatile components of the distillate after saccharification, fermentation and distillation, while the control group was without starter. The results showed that, Rhizopus oryzae G12 had strong alcohol-producing ability, with the average liquor yield of 12.10 %. Meanwhile, the strain produced a large amount of n-propanol and fusel oils in solid-state fermentation, which contributed to the generation of fusel oils. The study provided a different idea for the reducing of the content of fusel oils in Xiaoqu Baijiu. (Trans. by HUANG Xiaoli)

Key words：Rhizopus oryzae; solid-state fermentation; metabolites analysis; Baijiu

作者简介：杨雨琨，学生。

收稿日期：2016-03-01

DOI：10.13746/j.njkj.2016063

中图分类号：TS261.1；TS262.3；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）04-0122-03

优先数字出版时间：2016-03-14；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160314.1133.001.html。