耿胜男，郑亚秋， 孟明静， 杜钢

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004



Western blot法测定N-cadherin在创伤修复过程中的作用

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004

摘要：〔目的〕 测定小鼠创伤后N-cadherin蛋白的表达，探讨N-cadherin在创伤修复中的作用。 〔方法〕 用皮肤切除法在小鼠背部建立1 cm2小鼠皮肤创伤模型,分为复方组,腺嘌呤组,模型组和正常对照组。复方组小鼠给予中药复方制剂[附子(制)∶三七∶紫草=1∶2∶3]；腺嘌呤组给予腺嘌呤；模型组不给药。实验结束后，观察创伤面积及修复的快慢程度变化。创伤组织皮肤提取蛋白，Western blot法测定皮肤组织EMT过程中N-cad在创伤修复中表达的程度高低。〔结果〕 复方组小鼠背部创伤恢复最快，其次为模型组，腺嘌呤组小鼠创伤愈合最慢；Western blot法测定显示，创伤后N-钙调素的表达从高到低依次为:腺嘌呤组、模型组、复方组，与正常对照组比较其差异具有统计学意义(P<0.05)。〔结论〕 复方组给予的中药复方制剂对小鼠创伤的愈合有促进作用，腺嘌呤组给予腺嘌呤造成小鼠阳虚模型，不利于小鼠创伤愈合；小鼠创伤后N-cad的表达越低，创伤修复越快。

关键词：Western blot；N-cadherin；创伤修复；小鼠

创伤一直对人类的生命健康存在着巨大的威胁，虽然科学家们对创伤的研究从未停止，但人们对创伤修复过程的发生机制却鲜有了解，因此我们针对上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中N-cadherin在创伤修复过程中的作用机制进行了探讨。EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转分化的现象，目前被看成参与肿瘤进展、与侵袭和转移有一定关系[1]。Cadherin家族的黏附分子对于生长发育过程中细胞的选择性聚集具有至关重要的作用。N-cadherin是能与钙离子结合的一种蛋白质。钙离子又被称为细胞内的第二信使，它的浓度变化可调节细胞的功能，这种调节功能主要是通过钙黏蛋白而实现的[2]。目前的许多研究[3]表明，N-cadherin的高表达对恶性肿瘤的分化程度、侵袭力、转移有促进作用，对创伤愈合也有一定影响，但对于N-cadherin在创伤修复中的作用机制目前尚不明确。我们通过Western blot法测定创伤皮肤组织中N-cadherin的表达情况，以探究N-cadherin在创伤修复中的作用机制。

1仪器与试剂

1.1试剂

生理盐水：称取0.9 g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100 mL；PBS：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.63 g，KH2PO40.24 g，溶于900 mL双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1 L；分离胶(12%)；双蒸水；质量分数为30%的丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，双丙烯酰胺0.82 g，去离子蒸馏水102.7 mL，溶解后过滤；分离缓冲液；质量分数为10%的SDS(十二烷基硫酸钠)：取100 g电泳级十二烷基硫酸钠，溶于900 mL蒸馏水中，加热至68 ℃助溶，加盐酸调pH值至7.2，加水定容至1 L，分装备用；质量分数为10%的AP(过硫酸铵)：取10 g过硫酸铵溶于100 mL蒸馏水中，最好现场配置，溶解后放入4 ℃冰箱中保存，保存时间为1周；TEMED N,N,N′,N′-四甲基乙二胺；电泳缓冲液(50×TAE Buffer)：称取Tris 242 g、EDTA二钠37.2 g，放入1 L烧杯中，向烧杯中加入约800 mL去离子水，充分搅拌均匀，加入57.1 mL的冰乙酸，充分溶解，用氢氧化钠调pH至8.3，加去离子水定容至1 L后室温保存，使用时稀释50倍；Marker；转移缓冲液：甘氨酸2.9 g，Tris 5.8 g，十二烷基硫酸钠0.37 g，甲醇200 mL，加水至1 L；奶粉；TBST：体积分数为20%的Tween-20 1.65 mL，TBS 700 mL混匀后使用，最好现场配置；ECL发光液；裂解液；Loading Buffe 1 M Tris-HCl 1.25 mL，十二烷基硫酸钠0.5 g，BPB 25 mg，甘油2.5 mL， 然后加入去离子水溶解后定容至5 mL，分装后室温保存[4]。

1.2动物

昆明小鼠，雄性，体质量(20±2)g，河南大学药理实验室提供。

1.3仪器

HDL洁净台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，-4 ℃/-20 ℃冰箱(博西华电器 有限公司，安徽),ElX800酶标仪(美国BIO-IEK),-4 ℃冰箱(上海杜氏实业有限公司),TDL-508台式离心机(上海安亭科学仪器厂),YN-ZD-2电热蒸馏水器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂),CHA-S恒温振荡器(常州国华电器有限公司),FA1004N 电子天平(上海精密仪器有限公司),电子体温计(泰克曼电子仪器有限公司，香港),ZH-YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪(淮北正华生物仪器设备有限公司),XFA6130全自动动物血细胞分析仪(南京普朗医疗设备有限公司),HT-100血流变黏度测试仪、DYY-7C型电泳仪(北京市六一仪器厂)。

2实验方法

2.1建立小鼠皮肤创伤模型

取64只雄性昆明小鼠，分为4组：空白对照组，模型组，复方组，腺嘌呤组。除空白组外均对小鼠的背部右后方造成创伤，创伤面积约为1 cm2。空白对照组为正常小鼠；创伤模型组小鼠背部创伤，不给药；复方组小鼠创伤后，每天给予中药复方制剂(附子(制)、三七、紫草配比为1∶2∶3，1 g/kg)按0.2 mL/10g的剂量灌胃；腺嘌呤组小鼠创伤后，每隔两天给予腺嘌呤(40 mg/kg)按0.2 mL/10g的剂量灌胃。从实验当天开始，每隔一天测小鼠体质量，每周测量自主活动、体温、创伤面积并记录。数据计算方法：创伤面积(mm2)=创伤长度×创伤宽度；小鼠存活率=(实验结束后小鼠数目/实验开始时小鼠数目)×100%。

2.2组织蛋白的提取

称取不同组别小鼠的创伤皮肤组织0.1 g，剪碎，置匀浆器中，加生理盐水或预冷的PBS 900 μL研磨成匀浆；取出匀浆，置于离心管，放入离心机中以2 500 r/min离心10 min；弃去上清液，留底层的细胞；加入200 μL裂解液，置于冰上裂解30 min，间隔10 min混匀1次，混4次，最终成微乳状，有絮状物。然后，置于离心机中，调至4 ℃，以12 000 r/min离心10 min，取上清液于EP管中，-20 ℃保存。

2.3BCA蛋白浓度测定

现代社会，人们在文化习俗、道德理念、价值观念以及行为方式等方面普遍而深刻地存在着差异、分歧和冲突。这些差异、分歧、冲突并没有明确有效的方式使其趋于融合。文化习俗、道德理念、价值观念以及行为方式的多元性意味着存在多种合理的价值以及关于共同的善的合理观念。社会各阶层可以自由地采纳其中一种价值观念，或是从某种利益出发把不同的价值结合在一起，还可以自由地形成本阶层关于良善生活的观念。“不同的生活方式崇尚不同的善和德性这一事实并非不完美的特征，而是人类可以以不同的生活方式很好地生活的标志”。[12]

BCA与二价铜离子的CuSO4等其他试剂组合成的试剂混合在一起显示为苹果绿色。在碱性条件下BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原成Cu+，一个Cu+螯合2个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿色形成紫色复合物，最大吸光度与蛋白质浓度成正比[5]。实验采用96孔板法：根据标准品和样品数量，将试剂A与试剂B按50∶1的比例配制适量的BCA工作液，充分混匀；将蛋白标准品按0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL加入96孔板的蛋白标准品孔中，加灭菌双蒸水补足到10 μL；取10 μL待测样品，加入到96孔板；向待测样品孔和蛋白标准孔中加入200 μL BCA工作液；37 ℃温水浴30 min后冷却至室温；用酶标仪526 nm波长测定吸光度。制作标准曲线，从中求出样品浓度[6]。

2.4Western bloting

Western blot，即蛋白质印迹法(免疫印迹试验)。它是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息[7]。

电泳过程如下：①模具准备及安装，安装后加双蒸水，检漏5 min。②放入分离胶(12%)两块，先加双蒸水6.6 mL，并依次加入质量分数为30%的丙烯酰胺8 mL、分离缓冲液5 mL、质量分数为10%的SDS 0.2 mL、质量分数为10%的AP(过硫酸铵)0.2 mL、TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)8 μL、双蒸水1 mL，30 min后倒掉。③制备浓缩胶2块：加双蒸水3.4 mL，并依次加入浓缩胶缓冲液0.630 mL(pH=6.8)、质量分数为10%的SDS 50 mL、质量分数为10%的AP(过硫酸铵)50 mL、TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)5 μL。④加浓缩胶，插上梳子后30 min聚凝，将凝胶放入电泳槽，加电泳缓冲液，轻轻拔出梳子，加5 μL marker，上样样品总蛋白120μg，80 V、0.5 h，120V、50 min。⑤切胶：将所有东西用转移缓冲液润，黑胶白膜，海绵在外。⑥转膜：横流200 mA，1.5 h。⑦封闭：将1 g奶粉溶于20 mLTBS，封闭2 h。⑧加一抗，置于4 ℃过夜，TBST洗7 min，共7遍。⑨加二抗，放置2 h，TBST洗7 min，共7遍。⑩加ECL发光液A、B各200 μL，后把膜放在保鲜膜上。

3结果

3.1对小鼠体质量的影响

与对照组小鼠相比较，复方组小鼠体质量下降，模型组体质量无明显变化，其他组小鼠体质量均未有明显变化。给药期间各组小鼠状态良好。结果见表1、图1。

表1　创伤后小鼠体重的变化(g)

图1　创伤后小鼠体质量生长曲线

3.2对自主活动的影响

表2　创伤后各组小鼠自主活动的变化

图2　实验期间小鼠自主活动变化

3.3对体温的影响

实验期间测小鼠的背温、腹温和尾温。发现背温和腹温有小幅度波动，但整体较平稳，P>0.05，没有显著性差异，但尾温在实验第5周有较大幅度的变化。结果见表3、图3、表4、图4、表5、图5。

表3　创伤后小鼠背温的变化(℃)

图3　实验期间各组小鼠背温的变化

组别1d6d12d18d复方组31.0±0.4331.2±0.6427.2±0.6330.2±0.63腺嘌呤组31.0±0.4331.0±0.4326.9±0.5631.6±0.9模型组30.1±0.7431.0±0.5327.4±0.6932.7±0.79

图4　实验期间各组小鼠腹温的变化

组别1d6d12d18d复方组26.8±1.3125.8±0.8319.3±0.3321.9±0.51腺嘌呤组25.8±0.5424.4±0.8319.0±0.2124.1±0.21模型组26.1±1.4225.6±1.0319.0±0.6125.1±3.04

图5　实验期间各组小鼠尾温的变化

3.4对创伤面积的影响

由表6可看出，造成创伤后：复方组的愈合率较高，分别为99.02%和98.9%，创伤恢复较快；腺嘌呤组创伤愈合最慢，愈合率为85.20%。从第1天、第6天、第12天、第18天各组的背部创伤照片也可看出：在第1天造成相同创伤面积后，第6天创伤面积已有缩小，但腺嘌呤组创伤愈合最缓慢，其次为模型组，复方组愈合最快；第12天各组创伤均恢复很多，复方组基本愈合，腺嘌呤组仍有明显创伤；第18天，复方组的创伤已愈合，腺嘌呤组有小面积创伤，但模型组比腺嘌呤组的创伤小。小鼠创伤面积比较见图6，存活率见表7。

表6　各组小鼠创伤面积及愈合率

图6　小鼠创伤面积比较

组别实验初始小鼠数实验结束后小鼠数小鼠存活率/%复方组161381.25腺嘌呤组161275.00模型组161593.75

3.5Western blot

图7为提取皮肤组织蛋白后Western blot法测得的各组N-cadherin的条带。从左至右依次为复方组、腺嘌呤组、正常对照组、模型组。从图中可看出腺嘌呤组N-cadherin的条带最亮，表明N-cadherin的含量最高，其次为模型组、正常对照组，复方组的表达最低。

图7　N-cadherin条带

4讨论

本实验主要探究EMT过程中N-cadherin对小鼠创伤修复的影响。EMT这一过程能够使在某些部位产生的上皮细胞从上皮组织分离，然后迁移到其他位置，这是正常发育、伤口愈合和恶性上皮肿瘤等发生的基础。有研究[6]证明，N-cadherin的表达水平与EMT的发生呈正相关。初步推测为N-cadherin的表达与创伤修复过程有关。对小鼠造成创伤后，复方组给药：附子、三七、紫草。从创伤修复的照片来看，复方组的小鼠背部创伤愈合最快，在第18天已经完全愈合，这表明复方组给药对小鼠创伤修复是有促进作用的。而且从Western blot法测定皮肤组织中N-cadherin的表达情况发现，4组小鼠的N-cadherin表达复方组是最低的，其次为模型组，同时模型组的创伤修复也较快。腺嘌呤组的创伤修复最慢，因为腺嘌呤可导致小鼠阳虚，使小鼠的体质量下降，生长发育和创伤修复也变得缓慢，Western blot测定后表现出腺嘌呤组N-cadherin的表达最高。模型组小鼠创伤恢复速度比腺嘌呤快而慢于复方组，Western blot条带显示模型组N-cadherin的表达高于复方组，低于腺嘌呤组和正常对照组。即4组小鼠皮肤组织中N-cadherin的表达从高到低为腺嘌呤组、正常对照组、模型组、复方组。根据这一结果可推断，在创伤修复的过程中N-cadherin的表达高低与创伤修复的快慢是成反比的，即N-钙调素的表达下调有利于创伤的修复。

参考文献：

[1] 周亚东，陈幸生. 原发性慢性静脉功能不全与基质金属蛋白酶、上皮间质转化之间的关系[J]. 医学综述，2013,19(5):795-797.

[2] 周蕾，张亚楠，刘婕，等. E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白启动子的构建及活性测定[J]. 军事医学，2014,38(11):860-862.

[3] 黎涛，马春山，李川，等. 非小细胞肺癌组织MAGE-1蛋白的Western印迹分析[J]. 实用医药杂志，2008,25(2):219-221.

[4] Xu Y, Zhu F, Xu S, et al. Anti-tumor effect of the extract from qingyihuaji formula on pancreatic cancer by down-regulating Notch-4 and Jagged-1[J]. J Tradit Chin Med, 2015,35(1):77-83.

[5] Kant V, Gopal A, Kumar D, et al. Curcu min-induced angiogenesis hastens wound healing in diabetic rats[J]. J Surg Res, 2015,193(2):978-88.

[6] 郭艳靓，朱鹤，高维强，等. 前列腺癌细胞中CD44、TRA-1-60、E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白的表达及意义[J]. 肿瘤，2014,34(7):579-583.

[责任编辑时 红]

The action of N-cadherin in the process of wound healing by western blot

Intitute of Pharmacy, Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

Abstract:〔Objective〕Investigating the expression of N-cadherin in wounded mice and deter minating the action of N-cadherin in the process of wound healing. 〔Methods〕1-cm-diameter skin wounds were inflicted on the back of mice, and divide into four groups: the group of Compound; the group of Adenine; the group of model; the group of blank.The group of compound was treated with compound preparation(monkshood:pseudo-ginseng:radix lithospermum=1∶2∶3); the group of Adenine was treated with Adenine; the group of model was treated nothing. After the experiment,observing the changes of wound area and speed of wound repair. Extracting the protein of the wound skin and investigating the level of N-cadherin of the wound skin in the process of EMT by western blot. 〔Results〕The speed of wound healing in compound group is the fastest,followed by the group of model,and the group of Adenine is the slowest. It shows that the expresstion of N-cadherin statue is :the group of Adenine is the highest, the group of model is higher and the group of compound is the lowest comparing with the control group (P<0.05).〔Conclusion〕The compound preparation is useful to wound healing.Adenine can resist wound healing.After injured,the lower N-cadherin’s expresstion the faster wound repaired.

Key words:Western blot; N-cadherin; wound repair; mice

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

作者简介：耿胜男(1994-)，女，河南开封人，硕士研究生，从事中药抗肿瘤药理学研究工作。 通信作者：杜钢军(1971-)，男，河南开封人，博士，教授，从事中药抗肿瘤药理学研究工作。

基金项目：国家自然科学基金项目(81173094)；河南省高校青年骨干教师项目(2010GGJS-025)

收稿日期：2015-10-12

文章编号：1672-7606(2016)01-0009-05