韩建军+宁娜+郁建生+邹宗尧+牟少霞

摘要： 利用响应面分析法对川芎阿魏酸的微波协同酶法提取工艺进行优化。在单因素试验基础上，选取纤维素酶用量、酶解温度、酶解pH值以及酶解时间进行了4因素3水平的Box-Behnken中心组合研究，通过响应面分析法对提取条件进行了优化，确定微波协同酶法提取川芎中阿魏酸的最佳工艺。试验结果表明：最佳酶解条件为纤维素酶用量3.6 mg/g、酶解pH值4.6、酶解时间52 min、酶解温度53 ℃，在该条件下，川芎阿魏酸的提取得率为89.18%。

关键词： 川芎；阿魏酸；纤维素酶；微波法；响应面；提取；优化

中图分类号： R284.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0284-04

川芎为伞形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，临床上用于治疗跌扑肿痛、月经不调等[1]。川芎含有挥发油类[2]、多糖类[3]、酚酸类[4]等多种化学成分，其中阿魏酸是川芎药材的质控成分[1]。体内药理试验研究表明，阿魏酸具有抗菌[5]、抗抑郁[6]、降压[7]等活性。

目前已报道的川芎中阿魏酸的提取方法主要有微波法[8]、回流法[9]、超高压提取法[10]等。其中微波法是通过微波能加热与药材相接触的溶剂，将目标成分从药材中转移至溶剂中的一个过程，具有高效、节能、污染低的特点[11]。生物酶解技术通过酶解作用可使植物细胞壁疏松、破裂，从而降低传质阻力，促进有效成分的溶出，提高有效成分提取率，因而被越来越多地用于中药有效成分的提取中[12]。本研究采用微波协同酶法提取川芎中阿魏酸，通过响应面法优化酶解条件，以期为川芎中阿魏酸的开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

川芎，购买于重庆市中药材市场，经铜仁职业技术学院梁玉勇教授鉴定为川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）；阿魏酸标准品，购于中国食品药品检定研究院；纤维素酶，购自天津利华酶制剂技术有限公司，酶活力为10 000 U/g；水为重蒸水；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

仪器：LC-20AT高效液相色谱仪（自动进样器、在线脱气机、二元泵、DAD检测器和LC-solution 色谱工作站，日本岛津公司）；LWMC-201型微波化学反应器（南京旋光科技有限公司）；AB-135S十万分之一电子天平（德国梅特勒公司）；RE-2000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；PHS-25型酸度计（杭州亚美电子仪器厂）；KS-600D 超声清洗机（宁波科生仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京科伟永鑫实验仪器设备厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 阿魏酸的含量测定

1.2.1.1 色谱条件[1] Kromasil-C18柱（5 μm，4.6 mm×150.0 mm）；流动相：甲醇-1%乙酸溶液（体积比30 ∶ 70）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：321 nm；进样量：10 μL。该色谱条件下理论塔板数以阿魏酸峰计算不低于4 000，该色谱条件下测定阿魏酸标准品及川芎药材得到的色谱结果见图1。

1.2.1.2 标准曲线的绘制 精确称取10.5 mg阿魏酸对照品置于25 mL棕色容量瓶中，并用70%甲醇定容，摇匀，得042 mg/mL阿魏酸标准溶液。精确移取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL阿魏酸对照品溶液至10 mL棕色容量瓶中，并用70%甲醇定容。精确吸取所配制的不同浓度的对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪，按照“1.2.1.1”节中的色谱条件测定峰面积，并以峰面积为纵坐标（y）、进样量（x）为横坐标绘制标准曲线：y=5 312x-1.034，r=0.999 9，线性范围：0.042～0.420 μg。

1.2.1.3 阿魏酸含量的测定 取经干燥至恒质量的浸膏适量置于10 mL棕色容量瓶中，并用70%甲醇溶解，所得溶液用0.45 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液10 μL按照“1.2.1.1”节的色谱条件进行测定，并根据峰面积计算阿魏酸的提取得率。阿魏酸提取得率按照如下公式进行计算：

阿魏酸提取得率=[提取得到的阿魏酸含量（g）/川芎药材中阿魏酸的含量（g）]×100%。

1.2.2 川芎中阿魏酸的提取工艺流程 川芎中阿魏酸的提取工艺流程：川芎→干燥、粉碎成粗粉（过24目筛）→酶解→微波提取→合并提取液→减压回收溶剂→浸膏→干燥至恒质量→测定阿魏酸含量，并计算阿魏酸提取得率。其中微波提取条件的工艺参数为：8倍量的50%乙醇、微波功率为150 W、提取次数为2次、提取时间为2 min/次。

1.3 酶解条件的单因素试验

1.3.1 纤维素酶用量对阿魏酸提取率的影响 准确称取 10 g 川芎粗粉置于装有100 mL蒸馏水的锥形瓶中，在酶解温度为50 ℃、酶解pH值为4.5、酶解时间为60 min的条件下，考察不同纤维素酶用量（1、2、3、4、5 mg/g）对阿魏酸提取率的影响。

1.3.2 酶解时间对阿魏酸提取率的影响 准确称取10 g川芎粗粉置于装有100 mL蒸馏水的锥形瓶中，在酶解pH值为4.5、纤维素酶用量为3 mg/g、酶解温度为50 ℃的条件下，考察不同酶解时间（30、40、50、60、70 min）对阿魏酸提取率的影响。

1.3.3 酶解pH值对阿魏酸提取率的影响 准确称取10 g川芎粗粉置于装有100 mL蒸馏水的锥形瓶中，在纤维素酶用量为3 mg/g、酶解温度为50 ℃、酶解时间为60 min的条件下，考察不同酶解pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）对阿魏酸提取率的影响。

1.3.4 酶解温度对阿魏酸提取率的影响 准确称取10 g川芎粗粉置于装有100 mL蒸馏水的锥形瓶中，在纤维素酶用量为3 mg/g、酶解pH值为4.5、酶解时间为60 min的条件下，考察不同酶解温度（35、40、45、50、55 ℃）对阿魏酸提取率的影响。

1.4 响应面法优化试验

根据单因素试验结果，以阿魏酸的提取得率为响应值，用Design-Expert 8.0软件的Box-Benhnken中心组合试验设计原理对所选变量进行响应面设计。通过对数据进行回归分析，预测微波协同酶法提取川芎中阿魏酸的最佳工艺参数。

2 结果与分析

2.1 酶解川芎药材的单因素试验结果

2.1.1 纤维素酶用量对川芎中阿魏酸提取得率的影响 由图2可知，酶用量在1～3 mg/g时，阿魏酸提取率随着酶用量的增加而明显升高；当纤维素酶用量继续增加时，阿魏酸提取得率增加缓慢。因此，纤维素酶用量宜选在3 mg/g左右。

2.1.2 酶解时间对川芎中阿魏酸提取得率的影响 由图3可知，阿魏酸提取得率随着酶解时间的增加而升高；当酶解时间超过50 min后，阿魏酸提取得率增加趋于平缓。因此，酶解时间宜选择在50 min左右。

2.1.3 酶解pH值对川芎中阿魏酸提取得率的影响 由图4可知，当酶解pH值为4.5时，阿魏酸提取得率最高。由于pH值过低或者过高都会影响纤维素酶活力，最终影响有效成分的提取，因此最佳酶解pH值选在4.5左右。

2.1.4 酶解温度对川芎中阿魏酸提取得率的影响 由图5可知，在酶解温度为35～50 ℃时，阿魏酸提取得率随着酶解温度的升高而增加；当酶解温度超过50 ℃时，阿魏酸提取得率有所下降，这是由于随着温度的不断升高，纤维素酶活性不断增强，但是当温度过高即超过了纤维素酶的最适温度时，则会引起纤维素酶失活。因此，酶解温度宜选择在50 ℃左右。

2.2 川芎阿魏酸提取工艺响应面法优化分析

根据上述单因素试验结果，以纤维素酶用量（X1）、酶解时间（X2）、酶解pH值（X3）和酶解温度（X4）4个因素为变量，以阿魏酸提取得率（Y）为响应值，根据Box-Behnken的中心组合设计原理进行4因素3水平试验。具体的试验因素及水平见表1，响应面分析方案及结果见表2。

由Design-Expert 8.0.6软件对表2中数据进行回归拟合得到的二元多项回归方程为：Y=88.16+3.17X1+1.95X2+3.38X3+1.99X4+0.28X1X2-0.65X1X3+1.44X1X4-3.30X2X3+1.23X2X4-0.41X3X4-3.00X12-3.56X22-4.54X32-5.45X42。

该模型回归方程的方差分析结果见表3，可以看出，模型极显著（P<0.000 1），失拟项（P=0.053）不显著，表明回归方程拟合度和可信度较高、试验误差较小，可用于指导阿魏酸提取试验设计。模型中R2为0.991 2，RAdj2为 0.982 4，表明响应值98.24%的变化来源于所选变量；模型的变异系数为0.83%（<10%），表明试验有良好的稳定性；模型的信噪比为34.315（>4），表明该模型适用于川芎阿魏酸提取工艺的优化。该回归方程中的一次项中，X3对阿魏酸提取得率的影响显著，X1、X2、X4对阿魏酸提取得率的影响极显著；交互项中X1X4、X2X3、X2X4对阿魏酸提取得率的影响极显著；二次项中X12、X22、X32、X42均对阿魏酸提取得率的影响极显著。根据回归方程中的各项系数及表3中回归方程结果可知，在所选因素范围内，各个因素对阿魏酸提取得率的影响顺序为：酶解pH值>纤维素酶用量>酶解温度> 酶解时间。

所考察的4个因素（纤维素酶用量、酶解时间、酶解pH值和酶解温度）两两交互作用对川芎中阿魏酸提取得率的影响见图6，响应曲面的坡度越陡峭，则表明因素交互作用对响应值的影响越显著。由图6可以看出，在所选的4个因素的交互作用中，酶解温度与纤维素酶用量的交互作用、酶解pH值与酶解时间的交互作用以及酶解时间与酶解温度的交互作用均对川芎中阿魏酸的提取得率有显著影响，其中以酶解pH值与酶解时间的交互作用对阿魏酸提取得率的影响最为显著。以上对响应面图的分析结果与表3的分析结果一致。

经过Design Expert 8.0.6软件的分析，得到川芎中阿魏酸酶解的最佳工艺条件为：纤维素酶用量3.58 mg/g、酶解时间52.35 min、酶解pH值4.62、酶解温度52.77 ℃，在此条件下，阿魏酸理论提取的得率为89.97%。为验证方法的可行性，采用上述酶解条件对川芎进行微波-酶法提取阿魏酸的试验，为方便操作，将上述优化的条件调整为纤维素酶用量3.6 mg/g、酶解时间52 min、酶解pH值4.6、酶解温度53 ℃，在优化条件下做3组平行试验，测得阿魏酸平均提取率为89.18%，试验结果与模型预测相对误差仅为0.88%。

3 结论

本研究以川芎中阿魏酸提取得率为指标，通过单因素试验对纤维素酶用量、酶解时间、酶解pH值以及酶解温度进行了考察。在此基础上，采用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken的中心组合试验设计响应面试验进而建立了数学模型，得到优化的酶解处理川芎药材的工艺条件，即纤维素酶用量为3.6 mg/g、酶解时间为52 min、酶解pH值为4.6、酶解温度为53 ℃，在该条件下川芎中阿魏酸的提取率达到89.18%。

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