◎ 段文凯，尹 涛，解玲琴

（1.台州科技职业学院，浙江 台州 318000；2.台州学院，浙江 台州 318000；3.台州恩泽医院，浙江 台州 318000）

随着科技的发展，人们对食品添加剂和色素的安全性越来越重视，天然色素的开发利用已成为食品添加剂和色素发展使用的总趋势。合成色素虽具有色泽鲜艳，着色力强，稳定性好，成本较低等优点，但合成色素不易降解、化学合成等特性使其具有严重的慢性毒性和致癌性[1,2]，因而迫切需要寻找一种安全友好的色素替代合成色素。天然食用色素具有色泽自然鲜艳、生物可降解、安全、无毒等优点，已越来越受到人们的关注。

花青素是一种类黄酮类天然色素，广泛存在于草莓、杨梅、葡萄等自然有色植物中[3]，具有很强的抗氧化能力[4]，并可预防心脑血管疾病、降低心脏病等的发病危险[5,6]，是一种应用前景十分广阔的植物功能成分[7-9]。

草莓是蔷薇科草莓属植物的通称，属多年生草本植物。草莓中含有丰富的维生素和花青素，是一种很好的花色素类色素资源。我国草莓栽培面积和产量一直居世界首位[9]，虽然我国草莓资源丰富，但仍未很好地开发利用，大多数仅用于榨汁或直接食用。近年来，研究人员已研究出多种草莓保鲜的工艺技术[10-12]，但离真正解决草莓贮藏变质问题仍很大差距。开展草莓的加工工艺研究不仅可解决草莓的保鲜贮存问题，还可扩大草莓的消费领域。草莓天然色素巨大的应用价值及良好的功效为草莓加工工艺提供一条很好的应用研究途径。本实验通过微波辅助萃取草莓花色素，以AB-8大孔吸附树脂纯化草莓花色素，以期找出草莓色素提取的最佳工艺，为草莓色素和植物天然色素的开发利用提供重要的理论依据，具有重要的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与器材

草莓采收于实验室，选果实成熟，色泽鲜艳,大小相近。除去叶、果柄 ,洗净 ,沥干水分放于冰箱中冷藏备用。

主要试剂：矢车菊素标准品（Cyanidin-3-O-glucoside），购 于Extrasynthèse公 司；DPPH（2,20-diphenyl-1-picrylhydrazyl）购自于Sigma公司；乙腈（色谱纯），甲酸，乙醇，均购自上海化学试剂有限公司。

主要仪器：微波萃取仪（CEM MARS Xpress，CEM Cooperation，Mattews，NC，USA），HPLC（Waters Corp），HPLC-MS（Waters Corp），冷冻真空干燥仪（美国Thermo公司），超声萃取仪（宁波江南仪器有限公司），超低温冰箱（三洋，日本松下公司），分光光度计（北京普析通用有限公司），高速冷冻离心机（美国Thermo公司）。

1.2 花青素测定方法

色素总含量的测定参考Kim等[13]及Zhou等[14]所述方法 ，将萃取液分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液以1∶3的比例混匀，然后在520 nm和700 nm下分别测定吸光度，按公式（1）计算：

A=（A520－A700）pH1.0 －（A520－A700）pH4.5 （1）式中：A520为520 nm下的吸光值，A700为700 nm下的吸光值；花青素含量按矢车菊素计算，其摩尔消光系数为29 600，分子量为484.48，当溶液A值为1时，

溶液的花青素含量为16.38 μg/mL。

1.3 微波萃取方法

取一定量的新鲜草莓，用乙醇做萃取剂，微波（400 W、60 ℃）萃取5 min，测量草莓花色素含量。

1.3.1 溶剂及最佳提取浓度的确定

在参考大量花青素提取工艺和提取溶剂的安全问题后，选择乙醇作为花色素的提取溶剂，并确定乙醇的最佳提取浓度，准确称取4份5 g新鲜草莓，分别加入浓度为25%、50%、75%、100%的乙醇溶液各20 mL，微波（400 W、60 ℃）萃取5 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液测草莓花色素含量。

1.3.2 最佳盐酸提取浓度的确定

取5 g新鲜草莓，加入20 mL 75%乙醇，分别加入0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2%的盐酸，摇匀，微波（400 W、60 ℃）萃取5 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液测草莓花色素含量。

1.3.3 最佳料液比的确定

分别称取5 g新鲜草莓4份，按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的比例与75%的乙醇溶液混合，于60 ℃水浴中提取60 min，冷却至室温，4 000 r/min离心5 min，取上清液测草莓花色素含量。

1.3.4 最佳提取温度的确定

准确称取5 g新鲜草莓4份，分别取浓度为75%的乙醇溶液20 mL混合，于40、60、80、100℃水浴中加热提取60 min，冷却至室温，4 000 r/min离心5 min，取上清液测草莓花色素含量。

1.3.5 最佳提取时间的确定

准确称取5 g新鲜草莓4份，加入6倍体积的萃取剂，分别于60 ℃水浴中加热提取5、10、15、20 min，冷却至室温，定容至相同体积，4 000 r/min离心5 min，取上清液测草莓花色素含量。

1.4 大孔树脂的静态吸附与解析方法

在草莓有效成分的纯化中，树脂的选择十分重要，所选的树脂不仅要对纯化的成分具有较强的吸附力，而且应是可逆吸附，易于洗脱。本实验选用两种型号的常用树脂，通过对比两种树脂对草莓色素含量的吸附率和洗脱率，确定适宜的树脂。

1.4.1 不同树脂对草莓花色素的吸附

准确称取2.000 g预处理好的AB-8大孔树脂于100 mL锥形瓶中，加入50 mL用设定pH值的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释的花青素粗提物，用封口膜密封，置于设定温度恒温振荡器上，吸附率公式如式（2）：

式中，Q为吸附率，A0为吸附前溶液中花青素质量浓度，mg/mL；A1为吸附后溶液中花青素质量浓度，mg/mL。

1.4.2 树脂解析实验

准确称取2.000 g吸附饱和的AB-8大孔树脂于100 mL锥形瓶中，加入50 mL设定浓度乙醇溶液，用保鲜膜封口，置于设定温度恒温振荡器上，以110 r/min的转速振荡，每隔设定时间取0.5 mL花青素解析液，测定吸光值，按公式（3）计算花青素解析率：

式中，P为解析率，A0为吸附前溶液中花青素质量浓度，mg/mL；A1为吸附后溶液中花青素质量浓度，mg/mL；A2为解析液中花青素质量浓度，mg/mL；V1为吸附液的体积，mL；V2为解析液体积，mL。

1.5 花青素干燥方法

真空干燥：取一定量花色素纯化液，在50 ℃下浓缩，浓缩液置于蒸发皿中，50 ℃挥发水分，成流动性较差的浸膏，50 ℃真空干燥得色素粉末。

2 结果与讨论

2.1 草莓花色素微波提取的最适条件

2.1.1 乙醇浓度对提取的影响

乙醇浓度对草莓花青素提取的影响如图1所示。由图1可知，草莓色素收率随乙醇浓度增加而提高，当乙醇浓度达75%后，再升高乙醇浓度草莓花色素提取量呈略有下降的趋势，高浓度的乙醇阻碍植物次级代谢产物的释放；因此，确定乙醇浓度75%时为最佳乙醇浓度。

图1 乙醇浓度对草莓花青素提取的影响图

2.1.2 盐酸浓度对色素提取的影响

花青素在酸性环境下稳定，在碱性环境下则易降解，萃取剂酸浓度对色素萃取收率有较大影响，如图2所示。由图2可知，盐酸浓度增加到1%时，色素收率达到最大，继续增加盐酸浓度，并不能提高色素的收率，这可能是盐酸浓度过高并不利于草莓花色素的稳定性。综合考虑，后续实验选择1%的盐酸作为萃取剂。

图2 盐酸浓度对草莓花青素提取的影响图

2.1.3 料比对提取的影响

料液比对草莓色素萃取得率的影响如图3所示，由图3可知，草莓色素收率随料液比增加而增大，但到一定程度后，继续增大料液比，对收率影响较小。这可能是因为料液比增大有利于目的产物充分接触萃取溶剂，但当料液比增大至一定量时，目的产物与溶剂接触完全，再继续增大，并不能增大分子碰撞的概率，同时浸提液越多，浓缩干燥能耗也越大，溶剂用量也越大，综合考虑，选择料比为1∶6为实验的料液比。

图3 料液比对草莓花青素提取的影响图

2.1.4 温度对萃取的影响

图4表明，色素在80 ℃以下收率值变化不大，尤其是60 ℃以下。温度高于60 ℃时，色素收率稍有增加，其原因可能是该溶液为色素粗提液，随着温度的升高可能其中的糖类等物质发生改变，而使得颜色变深。在一定阶段内，随着温度的升高提取效果也在不断变优异，但如果继续升温，提取效果反而降低。因为虽然升温有利于色素的溶出，但花青素的稳定性较差，温度升高，花青素会发生氧化、聚合，导致提取率下降；温度低时，花青素与蛋白质、纤维等分离较慢，也会导致提取率下降。100 ℃时花青素的稳定性降低，使得收率变小。故初步确定提取温度为60 ℃时的提取效果最好。

图4 温度对草莓花青素提取的影响图

2.1.5 萃取时间对提取的影响

理论上提取时间越长，越有利于花青素溶解提取，提取量越大。但由实验结果可知，花青素的提取量随提取时间的不同而不同，如图5所示。随着处理时间的增加，收率逐渐增加，但时间过长会导致体系温度过高，而引起草莓花青素破坏，从而出现收率下降。

图5 萃取时间对草莓花青素提取的影响图

2.2 大孔树脂的筛选

将萃取液减压浓缩，蒸发乙醇进样。

2.2.1 不同型号的大孔吸附树脂对草莓花色素的吸附情况

取4 g AB-8、D101树脂，加入25 mL色素（含量为：0.021 mg/L）再加入50 mL pH 1.0的缓冲液，160 r/min摇床震荡20、40、60、80、100、120 min和360 min，测定上清液色素含量，按公式（4）计算吸附率。

式中：C0为花青素吸附前的浓度，C1为花青素吸附后的浓度；由图6中的结果可看出，AB-8对草莓花色素的吸附率较高，对草莓花色素的吸附能力较强，吸附率达93.5%，效果最佳。

图6 静态吸附动力学曲线图

AB-8树脂是一种球状、弱极性聚合物吸附剂，其结构中仅有非离子化功能基，并附加亲水基团。基于独特的加工方法，AB-8树脂具有较大的比表面和适宜的孔径，草莓花色素是可溶于水的弱极性有机化合物，与AB-8大孔吸附树脂的表面极性相匹配。这些特性都决定了其对草莓花色素具有较高的吸附能力。根据实验结果，后续的实验选择AB-8树脂作为吸附剂，研究其对草莓花色素的吸附与解吸情况。

2.2.2 洗脱剂对AB-8的解析的影响

不同浓度的乙醇解吸液的解吸率如图7所示。从图7中可看出，当乙醇浓度为80%时，解吸液的解析率最高，解吸效果最好。乙醇浓度过高或过低，解吸效果都会下降。

图7 洗脱剂乙醇浓度对解析率的影响图

2.2.3 AB-8上柱实验

柱型号：60×1.5 cm，上样pH 1.0，上样量50 mL×0.021 mg/L，上样流速60 mL/h ，先用蒸馏水洗120 mL，再用80%的乙醇洗。

由图8可看出，洗脱剂用量达到50 mL时，草莓花色素开始被洗脱下来，洗脱剂用量达到140 mL时，树脂上的草莓花色素已基本上洗脱完全，故洗脱剂体积应控制在140 mL。

图8 上柱实验图

2.3 AB-8循环使用性能

准确称取5.0 g已活化的湿树脂上柱，分别用80%乙醇溶液及蒸馏水洗净。取配好的色素溶液在500 nm处测定吸光度A0=0.807，然后取该色素溶液50 mL进行流动吸附，控制流速为2 mL/min，测其流出液吸光度A，结果见表1。从表1中可以看出，树脂循环使用25次后，流出液的吸光度变化不大，树脂的吸附能力仅降低1.5%。

表1 重复使用对树脂的稳定性影响表

3 结论

（1）草莓花色素最佳提取条件为最佳提取条件为以75%乙醇+1%盐酸为萃取剂，微波功率400 W、温度60 ℃、提取时间15 min、料液比（W/V）1∶6。从实验结果可看出，微波和超声波处理通过打断色素与其结合、破碎组织细胞，在很大程度上提高草莓花色素的提取率。同时值得注意的是，微波处理过度会引起花色素的破坏。

（2）试验用两种大孔吸附树脂中，AB-8树脂对草莓花红色素分离纯化较为适宜。据静态吸附和动态吸附实验，初步确定AB-8型大孔树脂纯化草莓花色素的最佳工艺为：柱型号：60×1.5 cm，上样pH 1.0，上样量50 mL×0.021 mg/L，上样流速60 mL/h，先用蒸馏水洗120 mL，再用80%的乙醇洗。循环使用25次以后，吸附率仅降低1.5%。

参考文献：

[1]车双辉，杜琪珍，夏 明.天然蓝色素的研究进展[J]．食品研究与开发，2003（2）：18-20.

[2]杨志娟.我国天然色素的现状与发展方针[J].食品研究与开发，2003（2）：3-5.

[3]Kong JM，Chia LS，Goh NK，et al. Analysis and Biological Activities of Anthocyanins[J]. Phytochemistry，2003（5）：923-933.

[4]Bravo L. Polyphenols：Chemistry，Dietary Sources，Metabolism and Nutritional Significance [J]. Nutrition reviews，1998（11）：317-333.

[5]Zhang B，Buya M，Qin WJ，et al. Anthocyanins from Chinese Bayberry Extract Activate Transcription Factor Nrf2 in β Cells and Negatively Regulate Oxidative Stress-Induced Autophagy [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013（37）：8765-8772.

[6]Zhang B， Kang M， Xie Q，et al. Anthocyanins from Chinese Bayberry Extract Protect β Cells from Oxidative Stress-Mediated Injury via HO-1 Upregulation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011（2）：537-545.

[7]许正虹，高彦祥，石素兰，等.微波辅助萃取紫甘薯色素的研究[J].食品科学，2005（9）：234-239.

[8]赵慧芳，李维林，王小敏，等.黑莓果实色素纯化及干燥工艺研究[J]．食品科学，2009（12）：35-39.

[9]王忠和.中国草莓生产现状及发展建议[J].中国农村小康科技，2008（11）：21-22．

[10]严 灿，刘 升，贾丽娥，等.不同贮藏温度对草莓呼吸强度及品质的影响[J].制冷学报，2015（5）：37-42.

[11]曹 辉，王振斌，马海乐，等.草莓澄清汁的加工技术研究[J].食品科学，2007（4）：117-120.

[12]周文化，周其中，郑仕宏.低温发酵草莓橙汁酿制优质草莓酒[J].食品与机械，2008（4）：29-32.

[13]Kim D，Jeong SW，Lee CY. Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums [J].Food Chemistry，2003（3）：321-326.

[14]Zhou SH，Fang ZX，Lu Y，et al. Phenolics and antioxidant properties of bayberry (Myrica rubra Sieb. et Zucc.)Pomace [J].Food Chemistry，2009（2）：394-399.