高 波

哈药集团制药总厂 黑龙江哈尔滨 150000

试析反相高效液相色谱法分析注射用氨苄西林钠有关物质

高 波

哈药集团制药总厂 黑龙江哈尔滨 150000

目的：利用反相高效液相色谱法进行注射用氨苄西林钠有关物质的进行测定，并且对相关的物质进行分析。方法：使用的是UltimateTMXBC18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，流动相A是12%的醋酸溶液．2mol／L磷酸二氢钾溶液一乙腈一水，比例分别是0.5：50：50：900，流动相相B是12%的醋酸溶液-0.2mol／L磷酸二氢钾溶液一乙腈-水，比例分别是0.5：50：400：550，稳住必须要达到35℃，从流速上来看，需要达到1.0ml/min，色谱法检测的波长是254nm。结果：注射用氨苄西林的相关物质能够分离，氨苄西林闭环二聚物、氨苄西林开环二聚物和L-氨苄西林在主峰上的保留时间分别是3.5、2.8、0.7倍处出峰。结论：对注射用氨苄西林钠的三种杂质峰位进行定位。

反相高效液相色谱法；注射用氨苄西林钠；物质测定

氨苄西林在临床上使用的是极为广泛的，这是一种抗生素，这种抗生素属于 B-内酰胺类，有着贮存不稳定的特点，尤其是水溶液，非常不稳定，在使用的过程汇总是极容易出现损坏和变质的。临床使用氨苄西林的过程中，如果产生了免疫，主要是由于在生产和贮存的过程中产生了高分子聚合物等引起的，因此要对聚合物杂志进行科学的定位，除此之外，还要进行限量的检测。在实验的过程中，需要根据规定使用2.8倍主要成分在保留时间处的杂质峰是不明显的。在本次实验中，对梯度洗脱的方法进行了不断的完善。使用三根不同品牌的色谱柱对杂质峰进行确定，利用科学的实验方式对产品的质量提供依据。

一、仪器和试剂

使用的是岛津的高效液相色谱仪，具体包括Lc-solution工作站、SPD-M20ADAD检测器和SPD-M20A工作泵,乙腈使用的是色谱纯，氨苄西林的对照品在含量是86.5%和注射用氨苄西林钠，在实验的过程中，按照规格进行具体的确定。

二、方法和结果

（一）色谱条件

从色谱条件上来看，使用的填充剂是十八烷基硅烷键合硅胶，检测的波长是254nm，溶液的流速是1.0ml/min，使用的是进样量是20μ，流动相A是为12%醋酸溶液-0.2mol／L磷酸二氢钾溶液．乙腈．水，比例是0.5：50：50：900；流动相B是12 %醋酸溶液-0.2mol／L磷酸二氢钾溶液一乙腈．水，比例是0.5：50：400：550，在整个过程中使用的是梯度洗脱法，具体的情况如表1所示，tR指的是氨苄西林的出峰时间。

表1 梯度洗脱表

（二）溶液的配制

从溶液的配制上来看，相关的物质的供试品溶液在配制的过程中如下：要取本品，使用的是流动相A进行溶解，还要将流动相A进行稀释，这样能够制成3mg/ml的氨苄西林溶液。有关物质的对照品溶液配制的要求如下：要精密的量取相应的供试品溶液大约1ml,将这些溶液放置在量瓶中，量瓶的容积是100ml，需要使用流动相A对有关物质对照品溶液稀释到相应的刻度。空白辅料溶液在配制的过程中，必须要按照处方比例使用流动相A进行配制，主要是用来配制主药的空白辅料溶液，在配制的过程中，一定要注意配制比例，否则就不会起到相应的效果。在二聚物样品溶液配制的过程中，一定要取本品大约 0.2g，之后向里加水1.0ml，这样就可以使样品快速的溶解，在溶解之后，还要放入水浴中进行加热处理，水温必须要保持在60摄氏度左右，加热的时间是1h，量取0.5ml的溶液，将这些溶液放置在50ml的量瓶中，最后加流动相A稀释，稀释到相应的刻度。在进行含量测定溶液配制的过程中，需要使用流动相A进行供试品溶液的配制，对含氨苄西林为1mg/ml的溶液进行配制，对照品溶液在配置的过程中也是如此。

（三）专属性的实验

在进行专属性实验的过程中，必须要分别量取溶液配置中的空白辅料溶液、含量测定溶液、有关物质供试品溶液，之后按照色谱条件充分的进行实验，对色谱图全面的记录，结果表明，空白辅料对主药与有关物质检测没有任何干扰。具体的情况如图1所示：

图1：空白辅料（A）、对照品（B）和有关物质供试品（C）的色谱图

（四）杂质峰的定位

分别取有关物质供试品溶液、二聚物样品溶液在2.1色谱条件下进样，采用三根不同品牌色谱柱进行试验，测定结果见表2。

表2：各杂质与主成分相对保留时间比值

（五）进样精密度

取氨苄西林对照品溶液(约1mSm1)，／连续进样6次，峰面积的RSD为0．92%。

（六）稳定性考察取氨苄西林对照品溶液(约1mg／m1)，分别在配制后0、2、4、6、8h进样测定，5次测定峰面积的RSD为1．02%，表明氨苄西林溶液在8h内稳定。

（七）含量及有关物质测定

取有关物质供试品溶液、有关物质对照品溶液及含量测定溶液分别进样，在色谱条件测定并计算含量及有关物质，测定结果见表3。

表3：样品含量及有关物质测定结果表

三、讨论

（一）杂质峰定位

对氨苄西林中可能存在的22种杂质分别定位，本实验与文献在相同色谱条件下操作，测定不同厂家多批样品，采用与文献比较相对保留时间的方法，确定三种杂质峰位：L．氨苄西林、氨苄西林开环二聚物、氨苄西林闭环二聚物分别在相对主峰保留时间0.7、2.8、3.5倍处出峰。

（二）聚合物结构分析氨苄西林钠聚合物(二聚物及多聚物)有两种结构，见图2。一种为开环二聚物，另一种为闭环二聚物。中国药典规定2．8倍氨苄西林保留时间处为二聚物峰]，而未注明是开环还是闭环二聚物。本实验测定6批样品加热后均在3.5倍处峰面积明显增加，而在2.8倍处二聚物峰不明显，表明加热后主要形成闭环二聚物。

（三）实验方法

参考中国药典及其他文献基础上，改进实验方法，洗脱结束后设置在初始比例平衡20min，基线更平稳，主峰保留时间漂移少。本实验方法能洗脱并良好分离生产及贮存所产生的有关物质，但测定费时较长。

（四）注射用氨苄西林钠杂质比例分析

对本实验6批样品中各单个杂质占总杂质比例进行分析其中聚合物占总杂质约75%，L-氨苄西林占总杂质8%左右。生产中可针对性减少聚合物及 L-氨苄西林杂质产生，能较好提高产品质量。

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R927.2

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