冀锦华，王小兵，孟建宇，缪 恺

（1.内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物研究所，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古农牧业科学院作物育种与栽培研究所，内蒙古呼和浩特 010031；3.锡林郭勒盟创绿环境监理公司，内蒙古锡林浩特 026000）

森林土壤是指在木本植被下发育的各类土壤的总称，主要用于供给森林植物生活物质。森林土壤微生物是完成森林生态系统中物质循环和能量转化两大功能的主要力量。而森林土壤真菌作为森林土壤生态系统中一类非常重要的微生物群落，对森林中植物的生长、物质循环和能量流动发挥至关重要的作用。土壤真菌多样性一般包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性3个方面，而物种多样性是多样性研究中最基本的内容，主要是指区域内真菌物种组成的丰富度和分布的均匀度[1]。

土壤真菌多样性研究的方法主要有传统的分离培养方法和分子生物学研究方法，传统的分离方法主要有稀释平板法和土壤平板法等[2-3]。但传统的纯培养方法测得的微生物只占微生物总数的1%左右[4]，不能反映土壤中微生物分布的真实情况。Biolog鉴定和生物标记法以及变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）、限制性片段长度多态性技术（RFLP）、荧光原位杂交技术（FISH）等分子生物学技术虽然较传统方法有很大的进步，但其存在通量低，信息量小等缺点[5]，不能更细致更详细地对土壤微生物进行分析研究。与此同时，新一代高通量测序技术（next-generation sequencing technology，或被称为第二代测序技术）出现，数据产出通量高，准确率高，成本低。2007年焦磷酸高通量测序技术首次应用于土壤微生物16S rRNA基因遗传多样性研究[6]。Bates和Lienhard利用高通量测序分别对美国西南部生物土壤结皮和老挝热带草地中真菌的多样性进行了研究[7-8]。此外，Buee[9]、McGuire[10]和 Shi Ling-Ling[11]分别对不同类型森林中真菌多样性进行了研究。然而，目前尚缺乏应用高通量测序技术对大兴安岭森林土壤真菌多样性的分析。

本试验运用Miseq二代高通量测序平台对内蒙古大兴安岭兴安落叶松森林的表层土壤进行测序，对其微生物组成、丰度和多样性进行分析，揭示大兴安岭森林土壤中真菌多样性，为阐明森林土壤微生物群落与森林生态系统之间的关系积累依据。

1 研究区域概况

大兴安岭位于黑龙江省、内蒙古自治区东北部，是内蒙古高原和松辽平原的分水岭。平均海拔573 m，昼夜温差大，年平均气温-2.8℃，最低气温-54℃，年平均降水量746mm，气候属寒温带湿润季风气候，其原始森林茂密，是中国重要的林业基地之一。采样地点位于内蒙古大兴安岭森林生态系统定位站附近，地处大兴安岭西北坡，为中山山地，林地土壤以棕色针叶林土为主，土壤厚度0～10 cm（表面枯枝落叶除外），兴安落叶松是其主要树种，种植面积占总面积的79%。

2 材料和方法

2.1 样品采集

本试验土壤样品采自于内蒙古大兴安岭森林生态系统定位站（N 50°49′～50°51′，E 121°30′～121°31′）附近的原始兴安落叶松林区，采样时间为2014年9月。在相同树种的3个不同地点（海拔为784～142 m）进行采样。采集过程中先去除土壤表面的枯枝落叶，用经灭菌的采样铲采集暗棕壤表面0～10 cm深的土壤样品，部分样品迅速放入已灭菌的50 mL离心管，密封包装后放于冰盒中，运回实验室后存于-80℃低温冰箱中，进行样品总DNA提取等试验；将3个剩余的样品混合均匀，尽快进行理化指标的测定，每项指标测定3个重复。

2.2 理化性质的测定

土壤样品的有机质含量测定依据标准NY/T1121.6-2006，速效氮含量测定依据标准DB13/T843-2007，速效磷含量测定依据标准LY/T1233-1999，pH值测定依据标准NY/T1121.2-2006，含水量用烘干法测定。

2.3 样品基因组总DNA提取

用E.Z.N.A Soil DNA Kit（OMEGA，USA）对土样的基因组DNA按照说明书进行提取，得到的基因组DNA 用 TE 溶液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH值8.0）溶解，储存于-20℃用于后续研究。

2.4 ITS区高通量测序

先利用琼脂糖电泳对提取的基因组DNA进行完整性和浓度检测，再用Qubit2.0 DNA试剂盒对基因组DNA精确定量并确定PCR反应中加入DNA的量。用融合了Miseq测序平台通用引物的引物进行 PCR，对产物的 ITS区（Internal Transcribed Spacers）进行琼脂糖电泳、回收和定量，根据测得的DNA浓度把所有样品按1∶1比例混合，充分振荡均匀，对混合样品进行建库，利用Miseq测序平台进行高通量测序。

2.5 序列处理

在测序试验中，样品的序列引入了标示样本来源信息的barcode标签序列[12]更高质量、更精准的生物信息学分析，再对有效序列进行质量控制（QC），最后去除非靶区域序列和嵌合体。

2.6 多样性指数分析（Alpha-diversity）

得到优化序列后，为了解样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，把序列按相似性（0.97）进行操作分类单元（OTU，Operational Taxonomic Units）聚类分析，从每个分好的OTU中选一条代表序列（丰度最高），用RDP classifier（分类阈值为0.8）进行不同物种水平［kingdom（界），phylum（门），class（纲），order（目），family（科），genus（属）］的物种分类。

通过单样本的Alpha多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性。计算菌群丰度（Community richness） 的指数有 Chao、Ace；计算菌群多样性（Community diversity）的指数有 Shannon、Simpson；测序深度指数有Coverage。从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建稀释性曲线；利用样本在不同测序深度时的测序量来构建Shannon-Wiener曲线。

2.7 群落结构

由分类学分析结果可得知样本在各分类学水平下的群落结构组成，包括样本中含有的微生物种类和各类微生物的序列数及比例，即微生物的相对丰度。将群落结构分析用饼状图或柱状图等形式呈现出来，可在每个分类学水平进行群落结构的分析。

3 结果与分析

3.1 土壤理化性质

对3个不同地点的混合土样的理化性质进行测定。大兴安岭兴安落叶松森林表层土壤pH值为5.4左右，为酸性土壤，含水量为37.8%，有机质含量为114.08 g/kg，速效氮含量为554 mg/kg，速效磷含量为0.105 mg/kg。

3.2 多样性及群落结构分析

3.2.1 测序序列处理 经Miseq测序平台测序得到30 000多条原始序列，长度在60 bp左右，3 000多条序列长度在280 bp左右。经质控后的序列条数为4 411，大部分在 200～270 bp，其中，非目标区域扩增序列数为1 145，嵌合体数目为6条，最终可用于分析的序列数目为3 260。

3.2.2 多样性指数分析 样品经Miseq高通量测序得到的序列共分为51个OTU，Alpha多样性指数Shannon为 0.818 9，覆盖度（Coverage）为 0.855 9。样品测序覆盖度为85.6%，说明测序结果可以较好地反映土壤中微生物真实的群落结构。指数Chao和Ace估算的OTU数目分别为85和155，与实际聚类分析得到的OTU数目相差不大，可以大致反映土壤中真菌群落结构。

Shannon-Wiener曲线可反映样本在不同测序数量时的微生物多样性。样品的Shannon-Wiener曲线见图1，从图1中可以看出，样本的Shannon-Wiener曲线趋于平坦，可以大致反映样本中真菌菌群的多样性。

稀释性曲线用于比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。样品的稀释性曲线如图2，可以看出样品的稀释性曲线没有进入平坦的趋势，还在继续上升，说明测序深度不够，若增加测序深度会产生更多新的OTU。

3.2.3 群落结构分析 使用统计学的分析方法，对样本在不同分类水平上的真菌群落结构组成进行分析。样品测出的序列中未分类的类群和未分类的真菌只占很小部分，真菌群落结构在门水平（图3）上主要划分为4个门，分别有Basidiomycota（担子菌门）（0～97.91%）、Ascomycota（子囊菌门）（0～0.95%）、Zygomycota（接合菌门）（0～0.06%）及一小部分未分类类群（0.52%）和未分类的真菌菌群（0.55%）。

在纲水平（图4）上，Agaricomycetes（伞菌纲）占真菌群落的绝大多数，unclassified Fungi（未分类的真菌）、Eurotiomycetes（散囊菌纲）和 unclassified（未分类类群）的比例近乎相等，而且比例都较小，其他群落还有Sordariomycetes（粪壳菌纲）、unclassified Ascomycota（未分类的子囊菌纲）、Dothideomycetes（座囊菌纲）、Zygomycota class Incertae sedis（未确定分类地位的接合菌纲）、Ascomycota class Incertae sedis（未确定分类地位的子囊菌纲）、Saccharomycetes（酵母纲）、unclassified Basidiomycota（未分类的担子菌纲）、Leotiomycetes（锤舌菌纲），比例只占整个真菌群落的0.03%～0.12%，分布差异非常小。

样品中真菌群落结构在属水平上的组成见图5，类群unclassified Cantharellales未分类的鸡油菌目（97.52%）占绝大多数，unclassified Fungi未分类的真菌（0.55%）和unclassified未分类类群（0.52%）只占真菌菌群的一小部分，二者比例相近，剩余的真菌群落有 Cladophialophora属 （0.21%）、unclassified Thelephoraceae未分类的革菌科（0.18%）、unclassified Herpotrichiellaceae类群 （0.15%）、Minimedusa属（0.12%）、unclassified Ascomycota未分类的子囊菌门 （0.12%）、Exophiala 外瓶霉属 （0.06%）、Chaetosphaeria属（0.06%）、Podospora柄孢壳菌属（0.06%）、Capronia属（0.06%）、Scolecobasidium 齿梗孢属（0.03%）、Scheffersomyces属（0.03%）、Russula红菇属（0.03%）、unclassified Hysteriales未分类的纵裂菌目（0.03%）、Penicillium青霉菌属（0.03%）、Mycena小菇属（0.03%）、Mollisia软盘菌属（0.03%）、Umbelopsis伞状霉属（0.03%）和其他类群。样品中真菌群落在属水平上，除类群unclassified Cantharellales外其余类群所占比均很小，且差异不大。

4 讨论

高通量测序方法广泛应用于微生物多样性的分析，但一般用于少数不需要描述微生物时空多样性的样品的分析[13]。Buee等[9]运用454高通量测序法研究了森林土壤真菌结构多样性，结果表明：土壤真菌的数量和多样性远远高于先前的假设，其中少数真菌种类占据了土壤真菌数量的大部分。高通量焦磷酸测序的引入增加了微生物群落分析的准确度，但其主要的缺点是片段限制性[14]。与早期的高通量测序方法相比，新的高通量测序方法具有较高的灵敏度和产出通量，读长长，可以进行微生物群落成员的鉴定和相对定量，在土壤微生物多样性研究中可以获得更加丰富的信息。

O'Brien等[15]用ITS克隆文库从森林土壤中得到412个种系，森林土壤ITS克隆文库中的Ascomycota（子囊菌门）和Basidiomycota（担子菌门）序列比例（46%和41%）相差不大，而Zygomycota和Glomerom ycota占ITS克隆文库序列的1.5%和0.5%。但本研究中Basidiomycota（担子菌门）序列占大多数，与Ascomycota和Basidiomycota序列数目相比，Zygomycota的序列比例非常小，只占所有序列的0.06%。这与O'Brien的研究结果相差很大，但真菌菌群类型与Scott T.Bates对美国西南部生物土壤结皮中真菌类型的研究结果[7]一致，而且，Basidiomy cota和Ascomycota属于腐生营养土壤真菌[16]，在土壤真菌群落中占主导地位。

真菌在土壤中有特殊地位，其喜酸性使他们在酸性森林土壤中尤为重要。兴安落叶松林土壤微生物在种类上，经传统培养方法，李晓彤等[17]分离鉴定到真菌18属，其中，以青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、毛霉属（Mucor）和木霉属（Trichoderma）为优势属。而本试验从兴安落叶松林土样中得到21个属，其中，类群unclassified Cantharellales未分类的鸡油菌目（97.52%）占绝大多数，unclassified Fungi未分类的真菌（0.55%）和unclassified未分类类群（0.52%）只占真菌菌群的一小部分，二者比例相近。说明高通量测序得到的菌群多数为不可培养微生物。

Rousk J等[18]对耕地土壤中真菌群落研究发现，土壤中真菌的相对丰度不受pH值影响，pH值与真菌多样性相关性较小。土壤微生物群落受土壤质地、矿物质和植物残体的质量等多种因素的影响[17]。Scott T.Bates等[7]通过对美国西南部生物土壤结皮中真菌多样性模式研究发现，担子菌门的伞菌纲和银耳纲占生物土壤结皮中真菌群落的7%和1%；子囊菌门的座囊菌纲、散囊菌纲、茶渍纲、锤舌菌纲、李基那地衣纲、盘菌纲和粪壳菌纲分别占42%、6%、1%、4%、6%、10%和13%；接合菌门的接合菌纲占5%，其余不确定分类的菌群占5%；Lienhard等[8]对老挝热带草地中真菌群落研究发现，草地中真菌群落在门水平有Ascomycota（子囊菌门）、Basidiomycota（担子菌门）、Chytridiomycota（壶菌门）、其他类群、未分类类群和未知类群，同样，子囊菌门在真菌群落中比例较担子菌门高。前者研究的担子菌门的银耳纲和子囊菌门的茶渍纲、李基那地衣纲和盘菌纲以及后者中的壶菌门在本次测序结果中没有出现，而且本次结果中担子菌门的比例比子囊菌门高出很多，与二者结果不同。但其他关于森林土壤中真菌群落的研究[14]发现，担子菌门在真菌群落中的比例较子囊菌门高，这可能与土壤质地和植被类型有很大关系。

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