郝长春, 徐国庆, 王天月, 冯　盈,

亓翠玉, 高　峰, 孙文远, 孙润广

(陕西师范大学 物理学与信息技术学院, 陕西 西安 710119)



Fe3+离子与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析

郝长春, 徐国庆, 王天月, 冯盈,

亓翠玉, 高峰, 孙文远, 孙润广

(陕西师范大学 物理学与信息技术学院, 陕西 西安 710119)

摘要：利用荧光光谱法和紫外吸收光谱法在298、306和313 K的温度下研究了Fe(3+)与牛血清白蛋白(BSA)在生理缓冲液(pH=7.4,Tris-HCl)中的相互作用。实验结果表明: BSA受到Fe(3+)的作用发生静态猝灭过程, 并得到相互作用的结合常数K、结合位点数n以及相应的熵和焓等热力学参数。进一步发现：Fe(3+)与BSA主要通过静电力发生相互作用，吉布斯自由能变为负值说明相互作用发生结合是自发过程, 能量转移理论计算得到结合距离r为5.10 nm。同步荧光光谱实验表明Fe(3+)诱导BSA构象发生变化。

关键词:牛血清白蛋白; 荧光猝灭; 热力学参数; 同步荧光光谱

PACS: 32.50.+d

在哺乳动物循环系统中, 血清白蛋白是含量最多的蛋白质之一。它的重要功能是可以运输脂肪酸, 每个血清白蛋白分子最多可运输7个脂肪酸分子[1]。血清白蛋白广泛存在于血液中, 且容易提取, 因而血清白蛋白是最早被研究的蛋白质。牛血清白蛋白(BSA)作为理想的模型常被用来研究药物、配体、金属离子等物质与蛋白质之间的相互作用。BSA分子含有582个氨基酸分子, 17个二硫键, 16酪氨酸残基和2个色氨酸残基[2]。金属离子广泛存在于自然界中, 可以通过空气、水、土壤、食物等途径进入机体。铁是一种过渡金属元素, 人体中含有3~5 g, 是一种必需的微量元素。它是血红蛋白、酶和一些免疫系统的化学物质中重要的组成部分。研究结果表明, 铁可以提高机体的免疫力, 增加中性白细胞和吞噬细胞的吞噬能力[3-5]。金属离子对蛋白质发挥生物学功能起着关键性的作用。研究金属离子与蛋白质的结合作用是生命科学的重要内容, 是化学和生命科学研究的前沿领域, 许多人类的疾病与金属离子-蛋白质的异常相互作用相关。

荧光光谱法具有敏感度高、检测速度快、方法简单的特点, 常被用来研究蛋白质分子与外源物质间的相互作用。通过测量BSA固有荧光强度的变化来分析物质对BSA荧光团的猝灭机理。本文在298、306和313 K的温度下, 利用荧光光谱和紫外可见吸收光谱研究Fe3+与BSA相互作用的机理。结果表明Fe3+与BSA发生结合形成复合体结构。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白(BSA)从Sigma公司购买。FeCl3、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl等化学物质购于天津试剂公司。其他化学试剂均为分析纯, 实验用水为二次蒸馏水。

TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用有限责任公司); QM-40稳态瞬态荧光光谱仪(美国PTI公司), 75 W氙灯和水浴恒温控制。所有激发和发射狭缝宽度设定为2.0 nm。

1.2 实验方法

BSA溶于Tris-HCl(pH=7.4)中形成10-5mol/L的溶液。配10-4mol/L的FeCl3溶液。将3 mL的BSA 溶液加入到10 mL的试管内, 在不同的试管中分别加入100、200、300、400、500、 600、 700、800、900和1 000 μL 的Fe3+溶液。然后加入Tris-HCl缓冲液定容至10 mL, 反应1 h。在激发波长为280 nm, 温度分别为298、306、313 K的条件下测量荧光发射光谱在300~500 nm范围内的强度。固定BSA溶液的浓度, 依次滴加一定量的FeCl3溶液, 同步扫描Δλ分别为15和60 nm的荧光激发光谱图。

2 结果与讨论

2.1荧光猝灭

BSA分子含有3个固有的荧光残基：色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸, 在相同条件下三者荧光强度之比为100∶9∶0.5。苯丙氨酸的量子产率较低, 由于从酪氨酸到色氨酸的有效能量转移和荧光内滤效应, 因此酪氨酸实验中观察强度变化不明显, 所以确定色氨酸对BSA荧光发射贡献最大。

实验中，为了消除内滤效应产生的荧光猝灭, 可以通过下面公式[6]对荧光强度进行修正：

Fcor=Fobs×e(Aex+Aem)/2。

(1)

Fcor和Fobs是纠正后和实验观察到的荧光强度。Aex和Aem是猝灭剂和BSA在激发和发射波长时的吸收强度。

图1给出了在温度为298 K、pH=7.4 的Tris-HCl缓冲液环境下, Fe3+对BSA的影响。可以看出, 随着Fe3+浓度的增加, BSA的荧光强度明显减弱, 这表明BSA与Fe3+之间发生了相互作用。

图1　Fe3+对BSA的荧光猝灭光谱

其中a—k代表c(Fe3+)分别为：0、10、20、30、40、

50、60、70、80、90、100 μmol/L

注:T=298 K,λex=280 nm。

由图1的数据作出F/F0的值和Fe3+的浓度的关系图(见图2), 它们之间具有良好的线性关系。计算出在296、301和 307 K3个温度下的双分子猝灭过程速率常数Kq(见表1)。Kq值远大于最大扩散碰撞的动态猝灭常数2.0×1010L/(mol·s), 因此可以断定Fe3+对BSA的荧光猝灭过程可能是静态猝灭而非动态猝灭。

荧光猝灭通常分为静态猝灭和动态猝灭。动态猝灭常用Stern-Volmer方程[7]描述

(2)

其中:F0和F是BSA在有无猝灭剂情况下的强度;Q是猝灭剂的浓度;Ksv是Stern-Volmer猝灭常数;Kq是猝灭速率常数;τ0是BSA的平均寿命, 当猝灭剂不存在时其数值通常为5ns。Stern-Volmer方程可以通过F0/ F和Q图像的线性回归确定Ksv的值如表1所示。

图2 在不同温度下Fe3+对BSA猝灭的Stern-Volmer图

注：λex=280 nm,λem=346 nm,c(BSA)= 3×10-6mol/L。

表1 在不同温度下BSA-Fe3+系统

2.2Fe3+和BSA之间的结合常数和结合位点的分析

静态猝灭可以用方程(3)来描述。对于静态猝灭,结合常数Ka和结合位点n都可由double-logarithm方程中lg[F0-F)/F]和lgQ的斜率和截距[8]求出

(3)

图3给出了在不同温度下Fe3+对BSA猝灭过程中lg[(F0-F)/F]和lgQ关系的图, 同时可以获

图3　在不同温度下Fe3+ 对BSA猝灭

得BSA-Fe3+系统的结合常数和结合位点数, 如表2所示。结合常数和结合位点数随着温度的升高而降低。这一现象表明在298 K环境下BSA-Fe3+的结合能力比在306 K和313 K的环境下高。Fe3+-BSA的化合物稳定性随着温度的升高而逐渐降低。这一现象表明,此反应是吸热反应。

表2　BSA和Fe3+的结合常数和结合位点数

2.3Fe3 +与BSA相互作用的热力学分析和

相互作用力

氢键、静电力、范德华力和疏水相互作用是小分子与蛋白相互作用的原因。判断分子间相互作用的方法是通过热力学参数的变化来分析。计算方程[9]如下：

(4)

ΔG=ΔH-TΔS。

(5)

Ka是方程(3)中的连接常数,T是热力学温度,R是气体常数。通过方程(4)可以计算出焓变ΔH和熵变ΔS的关系图,见图4所示。吉布斯自由能的变化ΔG可以通过方程(5)获得。Fe3+与BSA相互作用过程中热力学参数ΔH、ΔS和ΔG的数值见表3。从表3中可以看出ΔH<0, ΔS>0这说明了静电力是Fe3+和BSA之间的主要内在结合力；而ΔG<0说明Fe3+和BSA的反应是自发形成。

图4　Fe3+和BSA结合的Van′t Hoff图

T/KΔH/(kJ·mol-1)ΔS/(J·(mol·K)-1)ΔG/(kJ·mol-1)R2298——-31.343—306-268.059794.325-24.9890.9997313——-19.428—

2.4Fe3+对BSA构象的影响

同步荧光光谱可以用于研究蛋白质随着周围环境的构象变化过程。当发射波长和激发波长差值Δλ=15 nm时显示酪氨酸残基的特征荧光,当Δλ=60 nm时, 可以观察到色氨酸残基的特征荧光[10-11]。

BSA-Fe3+系统的同步荧光光谱如图5所示。对于Fe3+系统来说, 酪氨酸残基的位置没有改变,但色氨酸残基的位置发生了红移,这意味着色氨酸残基周围亲水环境的极性增大, 说明BSA的构象发生了变化。

A.Δλ=15 nmB.Δλ=60 nm

图5不同Fe3+浓度下BSA的同步荧光光谱

Fig.5The synchronous fluorescence spectra of BSA at various concentrations of Fe3+

其中a—k代表c(Fe3+)分别为:0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5、12.0、13.5、15.0 μmol/L

注：T=298 K,pH=7.40,c(BSA)=3×10-6mol/L。

3 结论

本文通过荧光光谱和紫外可见吸收光谱研究了BSA与金属离子Fe3+之间的相互作用。结果表明, Fe3+的猝灭机制为静态猝灭。分子间相互作用力是静电力, 且反应自发进行。猝灭剂Fe3+的存在,导致BSA的构象发生了变化。

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〔责任编辑 李博〕

Fluorescence characterization of the interaction between Fe3+and bovine serum albumin

HAO Changchun, XU Guoqing, WANG Tianyue, FENG Ying,QI Cuiyu, GAO Feng, SUN Wenyuan, SUN Runguang

(School of Physics and Information Technology, Shaanxi Normal University,Xi′an 710119, Shaanxi, China)

Abstract:The interaction of Fe(3+ )with bovine serum albumin (BSA) in physiological buffer (pH=7.4, Tris-HCl) was studied by fluorescence and UV-vis absorption spectroscopy at 298, 306 and 313 K. The quenching mechanism of bovine serum albumin by Fe(3+ )was found to be a static quenching process. The binding constant K and number of binding sites n were measured by fluorescence quenching method. The thermodynamic parameters such as entropy change (ΔS), enthalpy change (ΔH) and Gibbs free-energy change (ΔG) for the reaction were also obtained. The electrostatic force played a major role for Fe(3+)-BSA, and the Gibbs free-energy change (ΔG) were always negative indicated that the binding was spontaneous process(r=5.10 nm). From the synchronous fluorescence spectra, it can be found that the binding of Fe(3+ )with BSA induced the conformational changes in BSA.

Keywords:bovine serum albumin; fluorescence quenching; thermodynamic parameters; the synchronous fluorescence spectra

中图分类号:O561.1

文献标志码:A

基金项目：国家自然科学基金(21402114,11544009); 中央高校基本科研业务费专项资金(GK201402010,GK201505037); 大学生勤助科研项目(KY2015YB48,KY2015YB47)

收稿日期：2015-11-10

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.02.223

文章编号：1672-4291(2016)02-0033-04

第一作者： 郝长春, 男, 博士, 副教授,研究方向为生物物理学。E-mail: haochangchun@snnu.edu.cn