张俊珂,曾　萍,宋永会,于会斌,关东明,刘瑞霞,2(.中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院,北京 00083；2.中国环境科学研究院,环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 0002；3.中国环境科学研究院,城市水环境科技创新基地,北京 0002；4.清华大学,国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室,北京00084)



受四环素影响的活性污泥胞内外聚合物特征

张俊珂1,2,3,曾萍2,3,4*,宋永会2,3,于会斌2,3,关东明1,刘瑞霞1,2(1.中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院,北京 100083；2.中国环境科学研究院,环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 100012；3.中国环境科学研究院,城市水环境科技创新基地,北京 100012；4.清华大学,国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室,北京100084)

摘要：利用离心加超声的方法对处理四环素抗生素废水的活性污泥胞外聚合物(EPS)和胞内聚合物(IPS)进行提取,将其分为-溶解型胞外聚合物(slime)、松散附着型胞外聚合物(LB)、紧密附着型胞外聚合物(TB)、胞内聚合物(IPS).用BCA法和蒽酮-硫酸法测定了各层EPS和IPS溶液中的蛋白质和多糖含量,同时用三维荧光光谱扫描(EEM)和同步荧光光谱扫描(SFS)对其中的溶解性有机物(DOM)进行定性和定量分析,结果表明在EPS中的蛋白质和多糖的含量高于IPS,且蛋白质含量均比多糖含量高,而在slime和IPS中的蛋白质和多糖的含量高于LB 和TB;低激发波长类色氨酸和高激发波长类色氨酸是EPS和IPS溶液的主要成分,且溶液中的溶解性代谢产物和芳香蛋白类物质相对含量在slime、LB、TB和IPS逐渐增加,而难降解有机物-腐殖酸类物质的相对含量逐渐降低;进水四环素浓度与污泥各层EPS和IPS溶液中DOM也具有较好的相关性;三维荧光法检测溶液中的DOM与化学分析测试出的蛋白质含量具有较好的相关性.

关键词：活性污泥；胞外聚合物(EPS)；胞内聚合物(IPS)；荧光检测技术；四环素

* 责任作者, 研究员, zengping71@hotmail.com

Key words：activated sludge；extracellular polymeric substance (EPS)；intracellular polymeric substance (IPS)；fluorescence detection technology；tetracycline

近年来,四环素作为一种广谱抗生素在医药和养殖行业普遍使用.大量残留的四环素随着人畜排泄物等进入到自然环境中,在各国的污水处理厂进水中其浓度可达毫克级,其对微生物及人类健康存在的潜在危险不容忽视[1].传统污水处理厂大多采用活性污泥法处理污水,而四环素在活性污泥表面具有较强吸附性能[2],抗生素对活性污泥,尤其是活性污泥的胞外聚合物(EPS)的影响不可忽视[3],但抗生素对活性污泥胞外和胞内聚合物各成分的影响尚不明晰.

EPS是一定微生物在一定条件下产生的高分子物质,普遍存在于活性污泥絮体内部和表面.EPS可以吸附外界的有机物和无机离子,达到去除污染物的目的;可以消化外界大分子物质以满足营养需求;还可以形成保护层抵抗有害的外部环境[2,4].研究认为EPS可以改变污泥的表面电荷、疏水性、颗粒粒径、絮凝沉淀和脱水性能等性质[4-8].

胞内聚合物(IPS)是微生物体内碳源或能量储藏的一种形式,主要包括多糖、类脂、多聚磷酸盐和硫粒等.有研究表明,污水中部分COD的去除主要是被微生物吸收后以IPS的形式储存起来了[9].

由于EPS和IPS在污水处理中的重要作用,越来越多的研究者对于EPS和IPS的组成及分布特征进行了研究.有研究表明[6,10],EPS的70%～80%是由蛋白质和多糖构成.在结构上[5,11],EPS可以分为溶解型EPS和结合型EPS(bound EPS).溶解型EPS包含了溶解性的大分子、胶体、黏性物质,又被称为黏液层,而结合型EPS包括了微生物的鞘、荚膜、松散结合聚合物和吸附的有机物,又被称为荚膜层.其中,结合型EPS又可分为位于外层的松散附着型胞外聚合物(LB)和内层的紧密附着型胞外聚合物(TB).逐层提取EPS后,溶液中就是由细胞组成的细胞相(pellet).超声处理可以将pellet打破,使得IPS从细胞内释放出来[12].

然而在污水生物处理系统中污泥的EPS和IPS组成成分的影响因素众多,变化较大,而目前对其成分和含量的研究还没有形成一种特定的研究方法.曹秀芹等[13]用蛋白质和多糖含量的测定来表征EPS的组成,刘燕等[14]用扫描电子显微镜和原子力显微镜来确认EPS的存在和形式,周健等[6]用多糖和DNA的含量来表征EPS的组成和数量,王红武等[7]、姚萌[15]用TOC、蛋白质和多糖来表征EPS的组成变化.近年来也有许多研究者利用三维荧光光谱技术对EPS的特征进行了研究[12,15-16].但对于EPS和IPS这个复杂的体系,大多数只是针对EPS进行了研究,缺乏IPS的研究数据以及两者间作为一个整体的认识[9,13,15,17-18],有一些研究者只对LB和TB进行了研究,较少关注slime的组成及成分含量特征[7].已有的研究或者只是利用一种方式进行了研究,或者是没有将几种方式结合起来分析样品,缺乏方法间的比较[7,15].

为了更好的认识受四环素影响的活性污泥的EPS和IPS的组成和分布特征,本文将传统的化学分析方法与荧光检测技术结合起来,在分别考察EPS溶液和IPS溶液中各组成成分的基础上,分析了EPS溶液和IPS溶液中溶解性有机物(DOM)含量变化与测定的蛋白质和多糖浓度的相关性,以期考察样品的各指标间的相互关系.同时还分析了进水四环素浓度与EPS和IPS中DOM的相关性,以期明确污泥EPS和IPS与四环素之间的相互作用.

1　材料与方法

1.1试验装置及操作条件

本研究所用样品采自实验室膜生物反应器(MBR),MBR反应器总容积为18L有效容积为15.5L,如图1所示.其运行采用序批式运行(SBR)方式,反应器运行周期为4h,其中进水10min,静置30min,排水10min.每个周期排水2L,HRT为4.17h.反应器的底部安装了微孔曝气盘为反应器供氧.反应器内放置两片聚偏氟乙烯(PVDF)平板膜(上海斯纳膜分离科技有限公司),有效膜面积为0.10m2/片,膜孔径≤0.1μm.额定膜通量10.0L/ (m2⋅h). MBR样品在反应器每个周期的排水前半个小时采集,样品1,2,3,4的采集时间分别为反应器开始运行后10,14,18,22d.采样后保存于4℃冰箱,24h内进行测试.

图1　MBR反应器示意Fig.1　Scheme of MBR

1.2进水水质

MBR进水以一定量的葡萄糖和四环素及无机盐溶液配置,平均COD为830mg/L.其中四环素浓度在63.4mg/L左右.无机盐溶液组成为: (NH4)2SO4500mg/L,KH2PO4400mg/L, K2HPO4100mg/L,MgSO4⋅7H2O 250mg/L,FeSO45mg/L, CaCl225mg/L,NiSO416mg/L,Na2BO7⋅10H2O 3.6mg/L,(NH4)6Mo7O24⋅H2O 7.2mg/L,ZnCl2⋅4H2O 11.5mg/L,CoCl2⋅6H2O 10.5mg/L,CuCl2⋅2H2O 5mg/L, MnCl2⋅4H2O 15mg/L.

1.3污泥胞外和胞内聚合物的提取

采用离心加超声组合的方式[12],将污泥样品分为slime、LB、TB、IPS.具体提取步骤如图2所示.

1.4样品测试

污泥样品MLSS、MLVSS按照标准法[19]测定. EPS溶液和IPS溶液中蛋白质采用改良型BCA测定法[17],多糖采用蒽酮-硫酸法[17].

上清液中四环素的测定:取沉降后上清液经0.45μm玻璃纤维滤膜过滤后的溶液,利用高效液相色谱法(HPLC,Agilent 1100,USA)测定其四环素含量.色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6x220mm 5μm),流动相为甲醇:含0.1%甲酸的纯水(25:75),检测波长为365nm,流速为1mL/min,柱温为30℃,进样量为20μL.三维荧光光谱扫描和同步荧光扫描:对提取的EPS溶液和IPS溶液分别进行三维荧光光谱扫描和同步荧光扫描(Hitachi F-7000,日立,日本).以氙灯为光源,设定电压700V.三维荧光光谱扫描设定狭缝宽带λEx为5nm,λEm为5nm;激发波长λEx为200～450nm,发射波长λEm为260～550nm;扫描速度为2400nm/ min.同时扫描空白样品-超纯水(Milli-Q)以消除拉曼散射.同步荧光扫描设定扫描波长λ为260～550nm,波长差Δλ=Em-Ex=30nm,扫描速度240nm/min.

图2　污泥胞外和胞内聚合物的提取流程Fig.2　Extraction process of EPS and IPS from activated sludge

三维荧光光谱扫描结束后,利用仪器自带软件将数据转换成激发波长x发射波长x荧光强度的矩阵图.当λEx=λEm时,会出现瑞丽散射,将矩阵图中瑞丽散射线上方数据置零,以消除瑞丽散射[12,20-22].利用origin软件对矩阵数据进行处理,得到光谱图,再利用寻峰法和区域积分法(FRI)对数据进行整合.同步扫描数据通过自带软件转换成波长/荧光强度数据,利用origin软件处理分析.

2　结果及分析

2.1MBR反应器中活性污泥MLSS、MLVSS及上清液中四环素浓度变化

对污泥样品的MLSS、MLVSS及上清液中四环素浓度测定,结果如表1所示.

表1　MBR反应器运行Table 1　Operation of MBR

从表1可知,第10d采样时(样品1)四环素去除率可以达到22.67%.随着反应的进行,微生物不断生长,反应器内MLSS和MLVSS都相应升高.活性污泥对于四环素的去除率也得到了提高,在第14d采样时(样品2)达到了48.50%.但随着四环素的累积,其对于微生物的毒害作用逐渐明显.在第18d采样时(样品3),其去除率降低到40.51%,而反应器中的四环素浓度也升高到了37.12mg/L.在第22d采样时(样品4),MLVSS的值明显降低.四个样品COD的去除率均在60%～75%之间,处理效果较稳定.

2.2污泥样品EPS和IPS中蛋白质和多糖含量

样品EPS和IPS中的蛋白质和多糖浓度测试结果如表2所示.

表2　EPS和IPS中蛋白质和多糖浓度(mg/gSS)Table 2　Protein and saccharides content in EPS and IPS (mg/gSS)

由表2可知,除了样品3稍有不同外,在样品1、样品2、样品4的各层提取物中,蛋白质含量均比多糖含量高,在样品1的TB溶液中,蛋白质含量甚至是多糖的51.4倍.蛋白质是保护细胞的主要物质.四环素作为抗生素,对细胞会产生破坏作用.在四环素的胁迫下,为了防止细胞受到四环素的伤害,细胞合成的蛋白质的含量增加,这与张微[17]的研究结果类似.且无论是蛋白质含量还是多糖含量,在各样品中均出现slime溶液和IPS溶液中含量比LB溶液和TB溶液中含量高的现象.Tu等[12]的研究中也发现了IPS溶液中的蛋白质和多糖含量普遍比slime、LB 和TB溶液中含量高的现象,但未发现slime溶液比其他两者溶液含量高的现象.这可能是由于Tu等[12]研究中所用的是市政污水厂的活性污泥,而本研究中所取污泥样品是处理四环素废水的活性污泥,两种污泥喂食的基质不同.统计胞外和胞内有机物含量的变化可知,由slime、LB、TB所组成的EPS溶液中有机物含量均比IPS溶液有机物含量高.这说明由微生物分泌的胞外聚合物比胞内聚合物中有机物的含量高.罗茜[23]和于洁[4]的研究发现四环素浓度为20mg/L时,活性污泥脱氢酶的活性非常低甚至接近0,活性污泥已不能正常利用外源性碳源,内源呼吸大大增强.IPS作为细胞的碳源和能源的储备物这时候就被利用起来.本研究中IPS溶液中有机物比EPS溶液中有机物含量少可能就是由于四环素的作用,活性污泥出现了内源呼吸现象的征兆.

2.3污泥样品EPS和IPS中DOM分布的三维荧光光谱(EEM)分析

表3　污泥样品EPS和IPS中Peak T1和 Peak T2特性Table 3　The characteristics of peak T1and peak T2of EPS and IPS in samples

2.3.1三维荧光光谱分析样品DOM组成三维荧光光谱能够对多组分复杂体系中荧光光谱(发射波长/激发波长,Em/Ex)重叠的对象进行光谱识别和解析表征,通过对荧光光谱图进行分析,根据谱图中荧光峰的强度、位置以及个数的变化,可以初步判断水体中DOM的分布组成.

在样品1、样品2、样品3、样品4的各层EPS和IPS中均检测到两个明显的类蛋白荧光峰(PeakT1和PeakT2).PeakT1和PeakT2中心位置分别约为Ex/Em=225～230/335～340和Ex/Em= 275～280/305～340,这与姚萌[15]、刘延利[16]、Tu 等[12]对市政污泥的研究结果类似,其中PeakT1属于低激发波长类色氨酸,PeakT2属于高激发波长类色氨酸[12,22,24-26].

分析提取的slime、LB、TB、IPS溶液中PeakT1、PeakT2的荧光强度发现,在16组数据中除了2组数据PeakT1/PeakT2的值在1以下外,其余都在1以上.这说明在本实验的污泥样品的胞外和胞内聚合物中,主要以PeakT1即低激发波长类色氨酸为主.同时分析PeakT1与PeakT2的变化,得知各样品中都存在slime和IPS中的峰强比LB和TB中强度大的现象.这与以蛋白质和多糖表征的有机物含量在各层EPS和IPS溶液中的分布规律一致.

2.3.2区域积分法分析样品中DOM组成原有的三维荧光分析技术仅利用几个数据点来定性分析DOM中的成分特征,而没有一种合适的定量方法来分析三维荧光光谱,Chen等[22]在2003年提出了区域积分法(FRI).区域积分法按照激发和发射波长的不同,将具有相似性质有机物的三维荧光光谱分为5个区域,分别为芳香蛋白类物质I、芳香蛋白类物质II、富里酸类物质、溶解性微生物代谢产物和腐殖酸类物质.通过积分计算特定荧光区域的积分体积,然后对积分体积进行标准化,就可以得到特定荧光区域积分标准体积,从而反映该区域的特定结构有机物的相对含量.

由图3可知,芳香蛋白类物质II、溶解性微生物代谢产物占污泥EPS和IPS中的大部分.随着聚合物逐渐接近细胞中心,溶解性代谢产物和芳香蛋白类物质相对含量逐渐增加,而难降解有机物-腐殖酸类物质的百分比含量逐渐降低.

图3　各样品DOM组成成分百分含量(%)Fig.3　The percentage of DOM components in activated sludge (%)

2.4污泥样品EPS和IPS中DOM分布的同步荧光扫描(SFS)分析和结果

各样品同步荧光扫描结果出现两个较为明显的荧光特征峰Peak a和Peak b.Peak a开始于260nm,结束于300nm.Peak b开始于300nm,结束于550nm.通过已有报道[27-28]可知,260～300nm范围内为的峰与蛋白质类物质有关,而300～550nm内的峰与腐殖质类物质有关,即Peak a属于蛋白质类物质,Peak b属于腐殖质类物质.

分析Peak a、Peak b的荧光强度在各种EPS溶液及IPS溶液中的变化可知,Peak a呈现出在slime溶液中和在IPS溶液中比较突出,而在LB溶液和TB溶液中强度较弱的趋势.这说明酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等物质在溶解型胞外聚合物和微生物细胞内部含量丰富.而Peak b在各样品中呈现出只在slime溶液中比较显著,在其他溶液中强度较弱,甚至检测不到的现象.Peak a和Peak b的变化规律与上一节中Peak T1和Peak T2的几乎一致.

为了对荧光区域内的物质进行定性和定量研究,通过origin软件对类蛋白类物质有关的荧光区域面积(A260～300)和腐殖质类物质有关的荧光区域面积(A300～550)进行计算,并计算A260～300/ A300～550值.结果如表4所示.由表可知,荧光区域面积A260～300、A300～550在样品EPS和IPS中的变化与Peak a和Peak b的变化规律相同.

表4　样品EPS和IPS中荧光区域面积A260～300、A300～550及A260～300/A300～550Table 4　Fluorescentarea of A260～300,A300～550and A260～300/ A300～550of EPS and IPS in activated sludge

续表4

3　相关性指数分析

3.1BCA法与荧光检测方法的相关性

荧光区域积分法在溶液中DOM的组成进行类别划分的同时,也对其中的各类物质进行了半定量测定.为验证其定量的有效性,利用经典的BCA法测定了各EPS溶液和IPS溶液中的蛋白质含量,并利用SPSS软件计算了区域积分法中各类物质的面积与经典法测定的蛋白质含量的相关性指数(表5).结果发现,各样品同区域积分面积的相关性指数在0.95以上,表明区域积分法与经典法具有较好的相关性.

表5　蛋白质与荧光区域积分相关性指数Table 5　Correlation index of protein with fluorescence regional integration of four samples

3.2荧光指数与四环素浓度的相关性指数

结合2.1中所列的四环素浓度值,利用SPSS软件计算四环素与污泥各层提取液中DOM组成成分的相关性(表6).计算结果显示污泥上清液中的四环素浓度与芳香蛋白类物质I、芳香蛋白类物质II、富里酸类物质、溶解性微生物代谢产物和腐殖酸类物质均呈现明显的负相关,即随着四环素浓度的升高,DOM浓度呈现明显的下降趋势.这说明四环素与污泥各层EPS和IPS都可以发生荧光猝灭效应.且与芳香蛋白类物质I和芳香蛋白类物质II间的相关性指数均在0.65以上,说明四环素与污泥组分中的这两类DOM间的猝灭效应更加明显.刘延利等[16]用三维荧光光谱法研究了活性污泥EPS和四环素的相互作用.在活性污泥EPS中发现了2种类蛋白荧光峰A(Ex/Em=225/340)和峰B(Ex/Em=280/338),其荧光强度随着盐酸四环素的加入而显著降低,峰A和盐酸四环素结合生成了不发荧光的物质,而峰B和盐酸四环素结合生成的物质在Ex/Em =295/416处发荧光.而且两种荧光峰与四环素的反应过程均属于静态猝灭过程.这与本研究的结果类似.

表6　区域划分中五类溶解性有机物与四环素浓度的相关性指数Table 6　Correlation index of 5kinds of DOM with tetracycline concentration

4　结论

4.1在受四环素影响的活性污泥的EPS和IPS溶液中,蛋白质含量均比多糖含量高.且由蛋白质和多糖代表的有机物的含量,在slime和IPS溶液中,比LB和TB溶液中高;而在EPS溶液中又比IPS溶液中含量高.

4.2低激发波长类色氨酸和高激发波长类色氨酸是EPS和IPS溶液的主要成分,且溶液中的溶解性代谢产物和芳香蛋白类物质相对含量在slime、LB、TB和IPS逐渐增加,而难降解有机物-腐殖酸类物质的相对含量逐渐降低.

4.3三维荧光法检测溶液中的DOM与化学分析测试出的蛋白质含量具有较好的相关性.进水四环素浓度与污泥各层EPS和IPS溶液中DOM也具有较好的相关性.四环素与污泥各层EPS和IPS都可以发生荧光猝灭效应,且与芳香蛋白类物质I和芳香蛋白类物质II间的猝灭效应较明显.

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The characteristics of extracellular polymeric substances and intracellular polymeric substances in activated sludge fed with tetracycline.

ZHANG Jun-ke1,2,3, ZENG Ping2,3,4*, SONG Yong-hui2,3, Yu Hui-bin2,3, GUAN dong-ming1,LIU Rui-xia2,3(1.School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology (Beijing), Beijing 100083, China；2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China；3.Department of Urban Water Environmental Research, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China；4.State Environmental Protection Key Laboratory of Microorganism Application and Risk Control (MARC), Tsinghua University, 100084 Beijing, China). China Environmental Science, 2016,36(3)：751～758

Abstract：Extracellular polymeric substances (EPS) and intracellular polymeric substances (IPS) of activated sludge feeding with tetracycline were divided into four parts, soluble extracellular polymeric substances (slime), loosely bound EPS (LB), tightly bound EPS (TB), intracellular polymeric substances (IPS) after extractionby centrifuge and ultrasonic process. Protein and polysaccharide were detected with BCA and anthrone-sulfuric acid method. At the same time, 3Dexcitation-emission spectral scan (EEM) and synchronous fluorescence spectrum scan (SFS) were applied to quantitatively and qualitatively analyze DOM in EPS and IPS. The results showed that the content of protein and polysaccharide in EPS was higher than that in IPS, and the content of protein was higher than that of polysaccharide. In slime and IPS, the content of protein and polysaccharide was higher than that in LB and TB. Tryptophan-like with low and high excitation wavelength was the main component of EPS and IPS. The content of microbial byproducts and aromatic proteins increased gradually in slime, LB, TB and IPS, while the refractory organic humic-like decreased. Influent tetracycline concentration has good correlation with DOM of EPS and IPS from activated sludge. And the DOM detected by EEM had good correlation with protein detected by chemical test.

作者简介：张俊珂(1991-),女,河南安阳人,硕士研究生,研究方向为水污染控制.

基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07203-002);国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室开放基金(NO.MARC 2012D008),环境基准与风险评估国家重点实验室基金

收稿日期：2015-06-28

中图分类号：X703.5

文献标识码：A

文章编号：1000-6923(2016)03-0751-08