宛柏杰, 林文武, 吴锦鸿, 陈晓敏, 吴祖建, 张　洁

(福建农林大学植物病毒研究所，福建省植物病毒学重点实验室，福建 福州 350002)



水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns6和外壳蛋白P8多克隆抗体的制备及其应用

宛柏杰, 林文武, 吴锦鸿, 陈晓敏, 吴祖建, 张洁

(福建农林大学植物病毒研究所，福建省植物病毒学重点实验室，福建 福州 350002)

摘要:利用RT-PCR的方法从感染水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV)的水稻中克隆该病毒的运动蛋白基因S6和外壳蛋白基因S8，通过Gateway系统进行原核表达，获得表达载体pDEST17-Pns6和pDEST17-P8，将表达载体转化E.coli Rosetta，经IPTG诱导表达后获得分子质量约为59和46 ku含HIS标签的融合蛋白.以诱导表达的目的蛋白为抗原，免疫注射新西兰大白兔制备多克隆抗体.结果表明，Western blot检测制备的Pns6和P8抗体可特异性检测RDV，间接ELISA测定Pns6和P8抗体的效价均约为6400倍，并建立了可靠、灵敏、特异的Dot-blot ELISA方法检测RDV.以上研究表明，RDV运动蛋白和外壳蛋白抗体均可应用于该病毒在田间的大规模调查和检测.

关键词:水稻矮缩病毒; 非结构蛋白Pns6; 外壳蛋白P8; 多克隆抗体; Dot-blot ELISA

水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus,RDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员之一[1].1883年首次在日本被发现，现分布于中国、日本、朝鲜、菲律宾、尼泊尔等东南亚水稻产区.在自然条件下，RDV由黑尾叶蝉(Nephotettixcincticeps)或电光叶蝉(Recilimadorsal)以持久性方式经卵传播[2].该病害为系统性侵染病害，植株感病后，所有分蘖均能发病，植株症状表现为显著矮缩，分蘖增多，叶色浓绿，叶片粗而僵直，沿叶脉出现白色虚线状斑点[3].2011年以来，该病害在我国南方稻区的浙江、江苏、安徽、福建等省普遍发生，并有逐年加重的趋势.因此，在水稻矮缩病毒发病早期进行监控和诊断，可以有效的减少稻田的损失.目前国内外用于检测植物病毒的方法主要包括RT-PCR、免疫学检测、电子显微镜观察、IC-RT-PCR、免疫电镜等方法.用RT-PCR和IC-RT-PCR的方法来检测水稻病毒，其特异性和敏感性都非常的高，但是花费的费用较高不适用于田间的检测预报；利用电镜和免疫电镜技术可以直观的看到病毒粒子，但是需要专业的技术人员和特殊的仪器；然而，免疫学检测方法具有特异性强、敏感性高、操作简便快速，不需要特殊设备条件的特点，可适用于田间病毒的大规模调查和快速检测[4].

RDV全基因组由12条双链RNA(double strand RNA, dsRNA)组成，编码7个结构蛋白(P1, P2, P3, P5, P7, P8 and P9)和5个非结构蛋白(Pns4, Pns6, Pns10, Pns11 and Pns12)[5-9].其中，Pns6含有类似于依赖ATP的RNA解旋酶的保守模式，其功能可能参与病毒的细胞间运动[10].P8在植物呼肠孤病毒第一亚组中高度保守,并且可以和RGDV外壳蛋白及核心颗粒进行体外异源重构并形成稳定的病毒粒子[11].特异性抗血清的制备是免疫学检测的基础，而抗原的质量决定了抗血清的特异性，目前为止，主要的抗原包括纯化的病毒粒子、表达病毒的外壳蛋白和人工合成的多肽[12].由于分离纯化RDV病毒容易丢失一些主要成分，人工合成多肽获得的抗血清特异性较差，因此，本研究对RDV的Pns6和P8进行原核诱导表达，制备了特异性多抗血清，并建立检测RDV的Dot-blot ELISA的方法，为该病毒的田间检测及预防提供了技术支持.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1RDV水稻毒株与黑尾叶蝉RDV病毒采自福建省福州市郊区有明显水稻矮缩病症状的水稻病样，并在本实验室水稻毒株圃种植保存.黑尾叶蝉采自福州郊区，于实验室养虫室中饲养.

1.1.2酶及生化试剂Gateway BP Clonase Enzyme Mix、LR Clonase Enzyme Mix购自Invitrogen公司；总RNA提取试剂Trizol、PCR凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒购自Omega公司；蛋白marker购自GeneStar公司；反转录试剂盒购自Promega公司；6×His单克隆抗体、IPTG、碱性磷酸酶标记的羊抗兔、BCIP/NBT购自Sigma公司；硝酸纤维素膜购自Amersham Pharmacia；Taq DNA聚合酶(含染料)购自北京康为世纪公司；其余试剂为国产分析纯.

1.1.3载体与菌株入门载体pDONR221、原核表达载体pDEST17由魏太云教授馈赠，大肠杆菌DH5α以及Rosetta菌株为本实验室保存.

1.2方法

1.2.1Pns6和P8基因的克隆和原核表达载体的构建根据GenBank中已登录的基因序列(M91653和D13773)设计引物进行PCR扩增，RDV-Pns6-F:5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGACACAGAAACTCTTTGC3′/RDV-Pns6-R:5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTTGTACACGGTAATAGCAAGTAG3′和RDV-P8-F:5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCACGCCAGATGTGGTTAG3′/RDV-P8-R:5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATTTGGTCGATAGTATCTTCCA3′(下划线标记的为Gateway重组位点).

Trizol法提取感染RDV病毒的水稻病叶的总RNA，利用反转录试剂盒合成第一链cDNA.以cDNA为模板并利用高保真酶进行PCR扩增，将得到的目的片段进行回收，回收产物与入门载体pDONR221在25 ℃条件下进行BP反应，得到的重组质粒pDONR221-Pns6和pDONR221-P8送华大基因公司测序，测序正确的质粒与表达载体pDEST17在25 ℃条件下进行LR重组反应，获得表达载体pDEST17-Pns6和pDEST17-P8.

1.2.2Pns6和P8重组蛋白的表达、纯化及融合蛋白鉴定分别将表达载体pDEST17-Pns6、pDEST17-P8转入Rosetta菌中，经PCR筛选正确的菌液接种于含Amp和Chl抗性的LB培养基中，37 ℃震荡培养至D600 nm0.4~0.6，加入IPTG，使其终浓度为1 mmol·L-1.在37 ℃下继续诱导表达4h后，吸取1mL菌液于12000 r·min-1离心1 min，得到的菌体用80 μL的无菌水重悬，加入20 μL的5×SDS Loading buffer，沸水中煮5 min后置于冰上使其冷却，再12000 r·min-1离心5 min.分别取10 μL上清液进行10% SDS-PAGE电泳分析.少量诱导成功后，进行大量诱导.通过超声波破碎仪器破碎菌体，对蛋白的可溶性进行分析，同时得到较为纯化的蛋白.利用6×His单克隆抗体参照Wu et al[13]的方法对纯化的融合蛋白进行Western blot分析.

1.2.3Pns6和P8重组蛋白的多抗血清的制备大量诱导的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳后，用预冷的KCl(0.1 mol·L-1)溶液染色2 min，可见乳白色条带.根据目的条带的大小割下白色条带，用生理盐水与等量弗氏佐剂进行充分研磨，得到的乳状液体作为免疫抗原，参考欧阳元龙等[14]方法注射新西兰大白兔，注射5次后动脉取血，并采用赵芹等[15]方法获得抗血清，分装后于-80 ℃保存备用.

1.2.4多克隆抗体的特异性检测及效价分析参照林林等[16]方法，提取健康水稻和感病水稻的总蛋白，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后通过半干转印法(电流 200 mA，时间 90 min)转印到PVDF膜上，经含5%脱脂奶粉的PBST封闭液于37 ℃摇床封闭1 h后，用PBST洗3遍，每次5 min.将PVDF膜置于1∶1000稀释的Pns6和P8抗血清中37 ℃孵育1 h.再用PBST洗3遍后，放入1∶20000稀释的anti-rabbit IgG-AP抗体中37 ℃孵育1 h.将PVDF膜用PBST洗3遍后放入BCIP/NBT显色液中避光显色，待颜色显现出来，取出PVDF膜，用去离子水终止反应.参考Wu et al[13]的方法，利用间接ELISA的方法测定抗体效价.

1.2.5Dot-blot ELISA检测RDV方法的建立取待检测样品用液氮研磨后，将提取的蛋白样品3 μL点到硝酸纤维素膜上晾干.将NC膜浸入封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST)中37 ℃下封闭1 h，取出NC膜，用含0.05% PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min；分别放入Pns6、P8免疫抗体(抗体稀释液1∶3000倍稀释)中37 ℃下孵育1 h；用PBST洗3遍，每次5 min；将膜放入用封闭缓冲液稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG二抗(1∶10000稀释)中37 ℃下孵育1 h；PBST洗涤3次后在NBT/BCIP显色底物中充分显色，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时，用双蒸水终止反应并记录检测结果.

2结果与分析

2.1Pns6和P8基因的克隆和原核表达载体的构建

通过RT-PCR从RDV感病水稻中扩增获得Pns6(1530 bp)和P8(1266 bp)基因的目的片段，再进行BP反应重组获得入门载体pDONR221-Pns6、pDONR221-P8.重组质粒测序结果显示：克隆的Pns6和P8基因与日本株具有高度同源性，并且读码框正确，可以用于后续的原核表达.通过LR反应及PCR验证得到表达载体pDEST17-Pns6、pDEST17-P8(图1).

2.2重组蛋白的表达、纯化及融合蛋白的鉴定

将重组载体pDEST17-Pns6和pDEST17-P8分别转化到表达菌株E.coliRosetta中，筛选出阳性克隆于液体LB培养基中37 ℃，250 r·min-1震荡培养.经1 mmol·L-1IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳检测，在约59和46 ku处出现与预测融合蛋白大小一致的条带(图2)，经超声波破碎发现，两者皆存在于沉淀中，均为不可溶蛋白(图3A、B).进一步利用6×His标签单克隆抗体进行Western blot分析发现，表达的重组蛋白均能与6×His单克隆抗体起特异性反应(图3C)，表明Pns6和P8蛋白已经在E.coliRosetta中正确融合表达.

2.3多克隆抗体的特异性和效价分析

提取健康水稻及感病水稻中的总蛋白，以获得的Pns6和P8抗体为一抗，进行Western blot分析.结果显示Pns6和P8抗体可以特异性结合病株提取液中的一条56和43 ku条带，而在健康水稻的提取液没有检测到任何条带(图4)，说明制备的抗血清具有很好的特异性.进一步采用间接ELISA法测定效价，以免疫前的兔血清为阴性对照，进行梯度稀释，结果表明，Pns6和P8抗体分别在稀释6400倍的情况下，阳性对照比阴性对照值仍有2倍以上关系，表明Pns6和P8抗体效价都为6400倍.

2.4Dot-blot ELISA 检测RDV方法的建立

将感染RDV的水稻、带毒叶蝉、水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)，南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)、健康水稻和无毒叶蝉提取液各3 μL分别点到硝酸纤维素膜上，重复2次，室温干燥、封闭后用封闭缓冲液稀释的多抗血清作为一抗(1∶500稀释)进行Dot-blot ELISA检测.结果显示，多抗血清只能与感染RDV的水稻和叶蝉发生反应产生特异性斑点，与RRSV、SRBSDV、健康水稻和无毒叶蝉提取液都没有任何反应,且Pns6、P8抗体显色结果一致.结果表明，该Dot-blot ELISA方法可以很好地用于水稻矮缩病的大量检测.

3讨论

水稻矮缩病是水稻上的一种严重病害，目前还没有有效的控制措施，因此，主要依靠发病早期对病害进行监控和诊断，并根据诊断结果提供有效的防治策略.本研究基于免疫学的检测方法，建立了一种Dot-blot ELISA检测方法.与传统检测水稻病毒RT-PCR和IC-RT-PCR的方法相比，本文建立的Dot-blot ELISA检测体系具有很高的准确性，同时又由于其操作简便且不需要复杂的仪器，克服了RT-PCR和IC-RT-PCR不易推广的不足之处，更适用于基层样品的大量检测，为田间病毒病害的鉴定及预测预报奠定了基础.

本研究通过在大肠杆菌里表达融合6×His的重组蛋白来制备抗体，克服了提纯病毒不纯的困难.此外，融合表达的蛋白不含有寄主植物的成分，以此产生的抗体特异性强，用血清学方法检测时不易出现假阳性，这为检测和研究病毒提供了有利条件[17].近年来通过将水稻病毒基因进行原核表达，来获得目的基因抗体的方法也得到了广泛的应用[18-19].通过对RDV编码的7个结构蛋白和5个非结构蛋白功能进行分析，选取了参与病毒在寄主中运动的非结构蛋白Pns6和病毒复制的主要外壳蛋白P8，作为病毒检测的靶标.与RDV其他功能蛋白相比，Pns6和P8蛋白在寄主体内的表达量较高，而在寄主感病早期病毒量相对较少，所以Pns6和P8蛋白是检测病毒的理想靶标.综上所述，本研究获得的抗血清可以很好的用于RDV的血清学检测，同时也为进一步研究蛋白在介体叶蝉及在水稻细胞中的定位及其功能奠定基础.

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(责任编辑:吴显达)

Preparation and application of polyclonalantibodies against non-structural protein Pns6 and coat protein P8 of Rice dwarf virus

WAN Baijie, LIN Wenwu, WU Jinhong, CHEN Xiaomin, WU Zujian, ZHANG Jie

(Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Abstract:A full length cDNA of Rice dwarf virus (RDV) segment S6 encoding movement protein and segment S8 encoding coat protein were cloned from infected rice samples by RT-PCR. Vectors of pDEST17-Pns6 and pDEST17-P8 were expressed via Gateaway system and followed by being transformed into E.coli Rosetta. Then the 59 and 46 ku HIS-tag fusion protein, obtained with the induction of IPTG from E.coli Rosetta cells, were used to immunize New Zealand Rabbits as an antigen for polyclonal antibodies production. Both Western blot and ELISA method proved that both antibodies could detect infected rice plants specifically, indirect ELISA method detection of antiserum titer of Pns6 and P8 were 6400 times. To summarize, Dot-blot ELISA was established for reliable, sensitive and specificfor RDV detection. Both antibodies against non-structural protein and coat protein of Rice dwarf virus could be applied to fast virus detection at field-scale.

Key words:Rice dwarf virus; non-structural protein Pns6; coat protein P8; polyclonal antibodies; Dot-blot ELISA

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.01.008

中图分类号:S435.111.4+9

文献标识码:A

文章编号:1671-5470(2016)01-0042-06

作者简介:宛柏杰(1991-)，男，硕士研究生.研究方向：分子植物病毒学.Email:1094830730@qq.com.通讯作者张洁(1983-)，女，讲师.研究方向：分子植物病毒学.Email:jiezhang3553@163.com.

基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金(新教师类)(20133515120004)；国家自然科学基金(31301640)；福建省教育厅科技项目(JA13103).

收稿日期：2015-04-14修回日期：2015-05-20