骆米娟, 张贺贺, 陈家骅, 杜迎刚, 何龙艳， 季清娥

(1.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；2.潍坊科技学院，山东 寿光 262700)



南亚实蝇成虫肠道细菌的分离与鉴定

骆米娟1, 张贺贺1, 陈家骅1, 杜迎刚2, 何龙艳1， 季清娥1

(1.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；2.潍坊科技学院，山东 寿光 262700)

摘要:采用传统的微生物培养和16S rDNA (V6-V8)高变区测序相结合的方法，从室内人工饲养的性成熟南亚实蝇雌虫肠道中分离、鉴定出21株细菌，均属于γ-变形菌门，分别为肠杆菌属(7株)、拉乌尔菌属(3株)、沙雷氏菌属(2株)、普罗维登斯菌属(2株)、不动杆菌属(1株)、柠檬酸杆菌属(1株)、西地西菌属(1株)和不可培养的细菌(4株)；从性成熟的南亚实蝇雄虫肠道内分离得到20株细菌，分别为细菌(7株)、克雷伯氏菌属(4株)、肠杆菌属(3株)、普罗维登斯菌属(2株)、沙雷氏菌属(1株)、摩根菌属(1株)、假单胞菌属(1株)和γ-变形杆菌(1株)，也均属于γ-变形菌门.由上可知，性成熟的南亚实蝇雌、雄成虫肠道共有细菌为肠杆菌属、普罗维登斯菌属和沙雷氏菌属，均属于肠杆菌科，表明肠杆菌科是南亚雌、雄成虫肠道细菌的优势菌群.

关键词:南亚实蝇; 肠道; 细菌; 肠杆菌科

南亚实蝇Bactroceratau(Walker)，亦称南亚寡鬃实蝇，俗称南瓜实蝇，属双翅目(Diptera)实蝇科(Trypetidae)果实蝇属(Bactrocera)，是一种食性较广的世界性检疫害虫[1]，严重危害丝瓜、南瓜、黄瓜等13种瓜类蔬菜和柑橘类、芒果、番石榴等70多种水果，给果蔬生产及贸易造成巨大的经济损失[2].目前，国内外对南亚实蝇的研究主要集中在生物学、生理学、生态学和综合防治[3-8]以及类群分化、系统发育和种的分子鉴定等几个方面[9-10]，而对南亚实蝇肠道微生物鲜有报道.

昆虫肠道中微生物种类繁多，昆虫在进化过程中，与肠道微生物相互合作、相互影响、协同进化，形成了不可分割的共生关系[11].肠道微生物在许多方面影响宿主昆虫的生理活动，如提供营养、协助抵抗外来天敌捕食及微生物侵染、解毒以及引起宿主免疫反应等[12-15]，同时宿主昆虫为肠道细菌群落的代谢活动提供微生态环境.

随着微生态学技术的日趋完善以及测序技术和分子生物学技术的进步，昆虫肠道细菌群落结构和肠道微生态系统的研究日益深入，取得了更为丰富的群落结构信息，但若想用生物学试验证明肠道微生物对宿主的作用，仍然需要借助传统的微生物学纯培养方法获得菌株材料.本文运用传统微生物分离和16S rRNA基因技术相结合的方法，分离、培养、鉴定了性成熟的南亚实蝇雌、雄成虫肠道细菌，并分析其群落结构，以期为进一步探讨南亚实蝇成虫肠道菌的功能及其生物防治提供技术支持和菌种储备.

1材料与方法

1.1供试虫源

供试性成熟的南亚实蝇雌、雄成虫来自福建农林大学益虫研究所，已在所内人工繁育23代.养虫室饲养条件：室内温度(25±2) ℃、相对湿度65%±5%、光周期为L∶D=14∶10.

1.2成虫肠道解剖

随机选取实验室饲养的性成熟的南亚实蝇雌、雄成虫各30头，置于加有PBS缓冲液的离心管中浸泡1 min，倒掉PBS缓冲液，重复1次，再用75%酒精冲洗2次，每次2 min，倒掉酒精.在超净工作台内取出虫体并用无菌水漂洗3次，然后在加有无菌蒸馏水的培养皿中将其解剖.将肠道内含物研磨、溶解于1 mL无菌水中混匀备用.

1.3成虫肠道菌的分离与纯化

将上述提取的肠道内容物按照10-5、10-6、10-7进行梯度稀释，取200 μL稀释菌液，用无菌涂布棒分别均匀涂布于LB、NA平板培养基上，静置5~10 min；将上述稀释平板置于37 ℃电热恒温培养箱内，倒置培养1~2 d.用接种环挑取生长较好、颜色及形态不同、菌落较大的单菌落，在LB平板上进行数次三区划线分离，直到得到单一的纯菌落.将纯化后得到的菌株于NA斜面上置于4 ℃冰箱内保藏备用.所有操作均在无菌条件下进行.

1.416S rRNA基因扩增

在无菌条件下，用接种环分别挑取NA斜面上的菌株，接入1 mL经高压灭过菌的NB培养基中，然后在37 ℃、180 r·min-1的恒温振荡培养箱中振荡培养.采用菌液PCR的方法，用16S rDNA的通用引物968GC(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC)和L1401(CGGTGTGTACAAGACCC)对V6-V8区间片段进行扩增.PCR反应体系(30 μL)：10×PCR bufferⅡ(with Mg2+) 3.0 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，968GC和L1401各0.5 μL，菌液1 μL，TaKaRa LaTaq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，ddH2O 24.0 μL.PCR反应条件：95 ℃预变性5 min、94 ℃ 变性30 s、56 ℃ 退火30 s、72 ℃ 复性1 min，共30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保温.分别取3 μL PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳，观察有无500 bp左右的条带，阴性对照为不加DNA模板的反应体系，以检测样品是否被污染.检测后的PCR产物送上海铂尚生物技术有限公司测序，所用测序仪为ABI 3730 XL，测序引物为968GC和L1401.

1.5系统发育树的构建

从NCBI GenBank数据库选取各个菌株的近缘序列，利用Clustal X软件对测序获得的16S rRNA基因序列和与之近缘的已知序列进行多序列比对，利用MEGA 5.0软件的邻位相连算法构建系统发育树，bootstrap值设定为1 000.

2结果与分析

2.1肠道内分离的可培养菌及16S rDNA扩增结果

从性成熟的南亚实蝇雌成虫肠道得到78株单菌株，雄虫肠道得到48株单菌株，分别以这126株单菌株的菌液为模板扩增16S rRNA基因，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，获得的细菌16S rDNA片段大小在500 bp左右，是试验所需的目的片段(图1).

2.2单菌株16S rDNA序列分析结果

经PCR扩增产物并测序得到41条不同序列，其中21条来自南亚实蝇的雌性肠道，20条来自雄性肠道.将所测得的序列提交NCBI进行blast同源性比对发现,在所分离得到的细菌中,与GenBank数据库中已知16S rDNA序列相似性最高的为100%，最低的为97%；其中，40种细菌与已知序列相似性高于98%，1种细菌与已知序列相似性低于98%(表1).一般认为，16S rDNA序列同源性>99%，属于同一种；16S rDNA序列同源性<98%，属于不同的种[16].

比对结果表明,从南亚实蝇雌成虫肠道分离的21株细菌均属于γ-变形菌门(Gamma-proteobacteria).其中,4株[BF(6)、BF(28)、BF(31)和BF33]为不可培养的细菌(uncultured bacterium)，7株[BF(12)、BF(20)、BF(27)、BF(32)、BF16、BF18和BF23]属于肠杆菌属(Enterobacter)，3株[BF(33)、BF8和BF32]属于拉乌尔菌属(Raoultella)，2株[BF(1)和BF(18)]属于沙雷氏菌属(Serratia)，2株[BF(7)和BF(29)]属于普罗维登斯菌属(Providencia)；BF31属于不动杆菌属(Acinetobacter)，BF(17)属于柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，BF(34)属于西地西菌属(Cedecea).可见，肠杆菌属为优势菌.

从南亚实蝇雄成虫肠道分离的20株细菌也均属于γ-变形菌门.其中,7株(BM4、BM7、BM15、BM34、BM35、BM40和BM43)为uncultured bacterium/bacterium，4株(BM1、BM14、BM21和BM26)属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)，3株(BM6、BM8和BM33)属于肠杆菌属，2株(BM29和BM41)属于普罗维登斯菌属，1株(BM12)属于沙雷氏菌属，1株(BM30)属于假单胞菌属(Pseudomonas)，1株(BM36)属于摩根菌属(Morganella)，1株(BM2)属于γ-变形杆菌(gamma Proteobacterium).可见，克雷伯氏菌属为优势菌.

由上可知，南亚实蝇雌、雄成虫肠道的共有细菌为肠杆菌属、沙雷氏菌属和普罗维登斯菌属.

表1　南亚实蝇成虫肠道细菌16S rDNA序列的blast比对结果1)

1)BF.南亚实蝇雌性成虫;BM.南亚实蝇雄性成虫.

2.3肠道菌系统发育分析

对测序得到的南亚实蝇性成熟雌、雄成虫的肠道细菌16S rDNA序列进行系统进化分析，结果见图2~3.南亚实蝇雌成虫肠道细菌可以归入7个属(Enterobacter、Serratia、Providencia、Cedecea、Citrobacter、Raoultella以及Acinetobacter)，分别在进化树上形成了独立的分支，且这7个属形成了一个以γ-变形菌门为家族的大分支(图2).南亚实蝇雄成虫肠道细菌可以归入6个属，且这6个属形成了一个以γ-变形菌门为家族的大分支(图3).这表明从南亚实蝇性成熟的雌、雄成虫肠道分离的所有细菌均为γ-变形菌门.

3结论与讨论

本研究采用传统微生物分离纯培养与16S rDNA技术相结合的方法分析了南亚实蝇性成熟的雌、雄成虫肠道菌的群落结构组成，从雌虫肠道中分离出21株细菌，分别属于Enterobacter、Serratia、Providencia、Raoultella、Acinetobacter、Citrobacter及Cedecea7个属；从雄虫肠道中分离出20株细菌，分别属于Klebsiella、Enterobacter、Providencia、Serratia、Morganella及Pseudomonas6个属.雌、雄成虫肠道共有的细菌为Enterobacter、Serratia及Providencia，而Enterobacter、Serratia、Raoultella、Providencia、Acinetobacter、Citrobacter、Cedecea、Klebsiella、Pseudomonas及Morganella均属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌.

系统进化分析表明，从南亚实蝇性成熟的雌、雄成虫肠道分离的41株细菌均属于γ-变形菌门.其中，肠杆菌科的细菌为优势菌群.这与国内外许多研究者认为的肠杆菌科是双翅目昆虫中最普遍的共生微生物[17]相一致.

王莉莉[18]从橘小实蝇(Bactroceradorsalis)雌性生殖系统中分离出的肠杆菌科细菌主要有Morganella、Kluyvera、Citrobacter、Raoultella及Enterobacter；本研究从南亚实蝇雌性成虫肠道中也分离出了Citrobacter、Raoultella及Enterobacter，说明这些菌可能是雌性实蝇共有属，与寄生部位无关.本研究从南亚实蝇雄性成虫肠道分离到了Morganella，而此前无Morganella的报道，这可能是由肠道与生殖系统结构存在差异所导致，有待进一步研究.另外，王洪秀[19]从橘小实蝇3个种群的肠道中均分离出肠杆菌科细菌，如Klebsiella、Citrobacter、Enterobacter及Serratia，这些菌在本研究中也被分离得到.Kuzina et al[20]利用传统培养技术从墨西哥实蝇(Anastrephaludens)的消化道内分离了大量的肠杆菌科菌群，主要属于Citrobacter，该属在本研究中也被分离得到.本研究还从南亚实蝇雌虫肠道中分离出了1株肠杆菌科的西地西菌属(Cedecea)细菌，此前未看到有关此类菌的报道，有待于进一步研究.综上可知，肠杆菌科的细菌普遍存在于实蝇体内.

Lyudmila et al[17]在墨西哥实蝇体内除了分离到肠杆菌科的细菌，还分离到假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的细菌.有研究证明,假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌具有抵抗病原真菌的作用，可以保护寄主免受真菌的侵害[21]；本研究也从南亚实蝇雄性成虫肠道分离到了1株Pseudomonas的细菌，对于此类菌的功能有待于进一步研究.

总体来看，从南亚实蝇雌、雄成虫肠道中分离到的科的种类较少，其原因可能是肠道结构不同，也可能是受培养基以及分离条件的限制，后续研究中可以通过增加培养基的种类、优化培养基和培养条件，分离出更多的细菌种属.此外，本研究分离出的细菌在肠道中的作用以及对寄主(如产卵、吸引及寿命)的影响有待于进一步研究.

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(责任编辑:杨郁霞)

Isolation and identification of bacteria in the intestinal tract of adultBactroceratau(Walker) (Diptera: Tephritidae)

LUO Mijuan1, ZHANG Hehe1, CHEN Jiahua1, DU Yinggang2, HE Longyan1, JI Qing′e1

(1.College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China；2.Weifang University of Science and Technology, Shouguang, Shandong 262700, China)

Abstract:21 strains of bacteria were isolated and identified from the intestinal tract of sexually matured female Bactrocera tau which were reared in the laboratory using traditional isolation and 16S rDNA (V6-V8 hypervariable region) sequencing technique. All bacteria strains belonged to the Gamma-proteobacteria phylum, which included Enterobacter (7 strains)， Raoultella (3 strains)， Serratia (2 strains)， Providencia (2 strains)， Acinetobacter (1 strain)， Citrobacter (1 strain)， Cedecea (1 strain) and uncultured bacteria (4 strains)． Similarly, 20 bacteria strains were isolated and identified from male B.tau and they also belonged to Gamma-proteobacteria phylum, which consisted of bacteria (7 strains)， Klebsiella (4 strains)， Enterobacter (3 strains)， Providencia (2 strains)， Serratia (1 strain )， Morganella (1 strain)， Pseudomonas (1 strain ) and gamma Proteobacterium (1 strain)． Bacteria genus which both females and males had in common were Enterobacter， Providencia and Serratia, which all belonged to Enterobacteriaceae． To summarize, Enterobacteriaceae was the dominant bacterium in intestinal tract of B.tau．

Key words:Bactrocera tau; intestinal tract; bacterium; Enterobacteriaceae

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.01.002

中图分类号:Q939.1; S435

文献标识码:A

文章编号:1671-5470(2016)01-0008-06

作者简介:骆米娟(1989-),女,硕士研究生.研究方向:昆虫生态与害虫综合治理.Email:mijuanluo@163.com.通讯作者季清娥(1968-),女,研究员.研究方向:农业昆虫与害虫防治.Email:707660390@qq.com.

基金项目:国家自然科学基金项目(11175046).

收稿日期：2015-05-11修回日期：2015-09-14