李善姬，杜路平，白雪松，葛红娟，梁承武（吉林医药学院，吉林吉林132013）



响应曲面设计优化红参提取液发酵条件

李善姬，杜路平，白雪松，葛红娟，梁承武*
（吉林医药学院，吉林吉林132013）

摘要：研究不同发酵因素，即发酵时间、酵母接种量、发酵温度对红参液中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量的影响。在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken（BB）试验设计，对红参液发酵条件进行优化。结果表明，发酵时间、酵母接种量、发酵温度对红参中人参总皂苷含量均有影响，且影响顺序为：发酵温度＞发酵时间＞酵母接种量。最佳发酵条件为：发酵时间41.80h、酵母接种量0.89g/L、发酵温度32.20℃，在此条件下人参总皂苷含量增加30.46%。

关键词：红参；人参总皂苷；响应曲面分析；酵母

人参被人们称为“百草之王”，是闻名遐迩的“东北三宝”之一，是驰名中外、老幼皆知的传统名贵中药材。红参是人参最常见的炮制品，即经过浸润、清洗、分选、蒸制、晾晒、烘干等工序而制成[1]，一方面容易保存，另一方面还降低了有神经毒性的田七素[2]。红参中主要活性成分是人参皂苷，现已分离50多种，具有抗氧化[3]、抗抑郁的作用[4]，抗疲劳和神经系统保护作用[5]，抗肿瘤[6-7]作用。

最近研究表明，发酵方法可以改变人参皂苷的糖链结构，促使其向稀有皂苷转化，从而改变红参中人参皂苷和稀有皂苷的含量，增强红参的药理活性，促进肠道吸收[8-10]。因此，发酵工艺是开发人参新产品的主要热点之一。

目前国内关于人参的研究较活跃，多集中在对不同提取方法对人参皂苷含量的影响、不同人参中皂苷含量的测定、人参皂苷中各单体皂苷的提取测定、人参皂苷的富集纯化工艺，以及人参皂苷的药理作用等方面的研究，但缺乏红参发酵的研究，鉴于酵母菌价廉易得，同时红参具有丰富的稀有皂苷和生物活性，因此，本试验拟使用安琪高活性干酵母对红参提取液进行发酵，以研究发酵条件对红参皂苷含量的影响，并确定最适宜的发酵条件，以便开发多功能的发酵红参的保健品，为红参保健品大规模产业化提供技术条件。

1　材料和方法

1.1材料与试剂

市售的五年制人参干品；安琪高活性干酵母；正丁醇、甲醇均为分析纯；人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品：中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯；去离子水。

1.2仪器与设备

红参发酵锅（韩国）；LC-20AT高效液相：日本岛津公司产品；CPA225D电子分析天平：德国赛多利斯公司产品；Symmetrix ODS-R C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱：美国Boston Analytics公司产品；FA1104N电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；HHS型-21-4数显式电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；202-1A型电热恒温干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司；KQ-100DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TD-5A离心机；MJP-150型霉菌培养箱：上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发器RE-52AA：上海亚荣生化仪器厂。

1.3方法

1.3.1基本流程

5年制人参干品→挑选清洗→去芦头→蒸、煮（红参发酵锅）→添加酵母→发酵→冰箱冷藏→离心→过滤→萃取→制成样品

1.3.2人参皂苷含量的测定

将样品按表1的梯度洗脱条件进行洗脱，测定其中的总皂苷及单体皂苷Rg1、Re、Rb1。《中国药典》也以人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量作为人参的质量标准[11]。人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的量合为人参总皂苷。

表1梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.3标准品溶液的制备

精密称取干燥好的人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成含人参皂苷Rg1 1.87 mg/mL、人参皂苷Re 2.16 mg/mL和人参皂苷Rb1 2.36 mg/mL的混合溶液，摇匀即可。

1.3.4红参供试品溶液的制备

红参液制备：购买市售的五年制人参干品，判断真伪后去芦头并洗净。称取人参，放在红参发酵锅蒸熟24 h。然后再补充水煮24 h制成红参液。

红参供试品溶液制备：精密量取红参液9 mL，在发酵及离心完成后，加水饱和正丁醇萃取4次，每次10 mL，收集正丁醇层，然后蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至1 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得红参供试品溶液。

1.3.5单因素试验设计方案

在维持一个发酵条件不变的情况下，依次改变发酵时间、酵母接种量、发酵温度，分别探究单一因素对红参液中人参总皂苷及皂苷Rg1、Re、Rb1含量的影响。单因素实验，保持其它的因素不变，改变一个因素，发酵时间定为36 h，酵母接种量定为0.9 g/L，发酵温度定为32℃。发酵时间采用24、30、36、42、48 h 5个水平；酵母接种量采用0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 g/L 5个水平；发酵温度采用28、30、32、34、36℃5个水平。

1.3.6响应曲面的试验设计

根据单因素试验结果，选取发酵时间、酵母接种量、发酵温度这3个因素，以红参液中总皂苷的含量为响应值，按照Box-Behnken（BBD）试验设计并且进行实验，设计为3因素3水平的响应曲面分析试验。

应用Design-Expert8.0.6软件采用Box-Behnken （BBD）试验设计，发酵时间（A）、酵母接种量（B）、发酵温度（C）为自变量，以-1、0、+1分别代表自变量的低、中、高水平。响应曲面因素与水平及编码值见表2。

表2响应曲面因素与水平及编码值Table 2 Factors and levels and Coded value of RSM

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1发酵时间对人参总皂苷含量的影响

发酵时间对人参总皂苷含量的影响见图1。

图1发酵时间对人参总皂苷含量的影响Fig.1 Fermentation time on the influence of ginseng total saponins

从图1可以看出，人参总皂苷的含量随着发酵时间的延长出现先上升后下降的趋势，在42 h时人参含量达到最大。这可能是由于随着时间的延长，使得红参液中的营养物质被消耗过多而变少，酵母菌的繁殖得不到充分的营养及大量代谢产物的抑制，导致酵母菌总数不断的减少，从而导致对人参单体皂苷之间的转化下降。因此，选取42 h为中心点进行响应曲面试验设计。

2.1.2酵母接种量对人参总皂苷含量的影响

酵母接种量对人参总皂苷含量的影响见图2。

图2酵母接种量对人参总皂苷含量的影响Fig.2 Yeast inoculation quantity on the influence of ginseng total saponin content

从图2可以看出，在0.9 g/L到1.1 g/L的过程中，人参总皂苷的含量的大致呈下降趋势，在酵母接种量为0.9 g/L的时候达到最大值。这可能是由于随着红参液中营养成分的消耗，不可能在满足更多的酵母菌的繁殖生长，进而导致酵母菌提前进入了衰亡期，使得转化人参皂苷开始下降。因此，本试验选取酵母接种量0.9 g/L为中心点进行响应曲面试验设计。

2.1.3发酵温度对人参总皂苷含量的影响

发酵温度对人参总皂苷含量的影响见图3。

图3发酵温度对人参总皂苷含量的影响Fig.3 Fermentation temperature on the influence of ginseng total saponin content

由图3可以看出，随着发酵温度由28℃增加到36℃过程中，人参总皂苷的含量呈现出先增加后下降的整体变化趋势，在32℃时达到最大值。发酵温度会影响到酵母菌的生长发育以及人参中各单体皂苷的相互转化，从而造成了发酵液中的总皂苷含量的差异变化。因此，选取32℃为中心点进行响应曲面试验设计。

2.2 Box-Behnken（BBD）试验结果及发酵条件的优化

2.2.1响应面方案及分析结果

响应面分析方案及试验结果见表3。

表3 Box-Behnken（BBD）分析方案及试验结果Table 3 The Box - Behnken（BBD）analysis and test results

2.2.2响应曲面回归方程及方差分析及模型可信度分析

应用Design Expert8.0.5对表3的结果进行分析，得出人参总皂苷含量R1与因素变量A，B，C的回归方程：R1 =-312.167 98 +2.063 92×A +67.900 12×B + 15.475 32×C－0.611 17×A×B + 1.255 77×10-4×A× C + 0.686 94×B×C－0.018 695×A2－36.395 38×B2－0.250 30×C2

或者编码的响应曲面二次回归方程模型为：

R1=10.44－0.098×A－0.13×B+0.25×C－0.37×A×B+ 0.015×A×C+0.14×B×C－0.67×A2－0.36×B2－1.00×C2

式中：R1为人参总皂苷含量；A为发酵时间；B为酵母接种量；C为发酵温度。

表4响应曲面方差分析表Table 4 Response surface analysis of variance

续表4响应曲面方差分析表Continue table 4 Response surface analysis of variance

由表4方差分析结果可知，该模型很显著（P＜0.0001），意味着只有小于0.01%的机会，模型的F值可能会出现大的抗噪能力；失拟项P＞0.05，不显著，表明该回归方程拟合性好，可用来预测实际的试验结果。

方程中一次项B，C，AB，二次项A2，B2，C2显著。表明各实验因素对响应值的影响并不是简单的线性关系。各因素对红参液中人参总皂苷含量影响大小关系顺序为发酵温度＞发酵时间＞酵母接种量，且3种因素对红参液中皂苷含量都有影响。

表5模型可信度分析Table 5 Analysis of model reliability

由模型可信度分析表5可知，该方程拟合度R2= 0.986 6，说明该模型能解释98.66 %的变化，表明方程拟合良好；C.V（人参总皂苷R1的变异系数）表示试验的精确度，C.V值越小，表明试验的可靠性越高；预测拟合度值0.8904与校正拟合度值0.969 3相近；信噪比（一般信噪比值大于或等于4即可取），试验信噪比为20.504，表明该模型可以用于指导试验设计。综上所述，该模型设计合理，可以用来对发酵条件对红参皂苷含量的影响进行分析和预测。

2.3试验因素交互作用分析

2.3.1发酵时间与酵母接种量

二者交互作用的影响见下图4（a）和（b）。

由图4（a）可知，保持酵母接种量不变，在较小的的发酵时间水平，随着发酵时间的延长，人参总皂苷浓度快速增加，而随着发酵时间的进一步延长，人参总皂苷浓度趋于平缓，达到峰值后略有下降。保持发酵时间不变，随着酵母接种量的增加，人参总皂苷浓度逐渐增至最大值，而后略有下降。所以推出，酵母接种量和发酵时间均对人参总皂苷含量有一定影响，且酵母接种量和发酵时间的交互作用对人参总皂苷含量也有影响。

图4发酵时间和酵母接种量交互影响的响应面曲线（a）与等高线（b）Fig.4 Response surface plot（a）and contour plot（b）of the effect of fermentation time and yeast inoculation quantity

2.3.2发酵时间与发酵温度

二者交互作用的影响见下图5（a）和（b）。

图5发酵时间和发酵温度交互影响的响应面曲线（a）与等高线（b）Fig.5 Response surface plot（a）and contour plot（b）of the effect of fermentation time and Fermentation temperature

由图5（a）可知，保持发酵时间不变，在较低的发酵温度水平，随着发酵温度的上升，人参总皂苷浓度快速增加，而随着发酵温度的进一步上升，人参总皂苷浓度增加趋于平缓，当达到峰值后，有下降。保持发酵温度不变，随着发酵时间的延长，人参总皂苷浓度逐渐增至最大值，当达到峰值后，略有下降。所以推出，发酵温度和发酵时间均对人参总皂苷含量有一定影响，且发酵温度和发酵时间的交互作用对人参总皂苷含量也有影响。2.3.3酵母接种量与发酵温度

二者交互作用影响见下图6（a）和（b）。

图6酵母接种量和发酵温度交互影响的响应面曲线（a）与等高线（b）Fig.6 Response surface plot（a）and contour plot（b）of the effect of yeast inoculation quantity and Fermentation temperature

由图6（a）可知，保持酵母接种量不变，在较低的发酵温度水平，随着发酵温度的上升，人参总皂苷浓度快速增加，而随着发酵温度的进一步上升，人参总皂苷浓度增加趋于平缓，当达到峰值后，开始下降。保持发酵温度不变，随着酵母接种量的增加，人参总皂苷浓度逐渐增至最大值，而后，略有下降。所以推出，酵母接种量和发酵时间均对人参总皂苷含量有一定影响，且酵母接种量和发酵时间的交互作用对人参皂苷含量也有影响。

通过上述分析可知，发酵时间、酵母接种量、发酵温度对红参液中人参总皂苷含量均有影响，且发酵温度对人参总皂苷浓度的影响最为显著，表现为曲线较陡，其次为发酵时间，影响相对较低的是酵母接种量，表现为曲面相对平滑。影响大小顺序为发酵温度＞发酵时间＞酵母接种量。

2.4响应曲面优化发酵条件

发酵条件的响应面优化值见表6。

表6响应面优化值Table 6 Response surface optimization value

由表6可知响应曲面优化最佳发酵条件为：发酵时间41.80 h，酵母接种量为0.89 g/L，发酵温度32.23℃，人参总皂苷浓度为10.464 5 mg/100 mL。

2.5验证试验

为检验响应曲面法所得结果的可靠性，联系实际操作的便利情况，对各因素适当调整。在调整后的试验因素下进行3次试验。将上述最佳工艺条件修正为：发酵时间为42 h、酵母接种量0.89 g/L、发酵温度32℃。结果见表7。

表7验证试验结果Table 7 Test results

由表7可知，试验结果有较好的重复性，3次试验的人参总皂苷浓度的平均值为10.492 3 mg/100 mL，实际测定值为（10.492 3±0.086 34）mg/100 mL，与理论预测值10.464 5相近（相对误差为0.27 %）。验证试验表明，回归模型可以比较好的拟合红参液的实际发酵过

程，具有较好的参考价值。

4　结论

本试验采用响应曲面法优化红参液发酵条件。结果表明，酵母发酵后的红参液中的人参总皂苷含量较发酵前的含量增加。发酵温度、发酵时间、酵母接种量对红参液中人参皂苷含量均有影响，且它们的影响不是简单地线性关系，3个因素影响主次关系为：发酵温度＞发酵时间＞酵母接种量。利用Design-Expert8.0.6软件对Box-Behnken（BBD）试验数据进行分析，结果表明,红参液发酵的最佳条件是：发酵时间为42 h、酵母接种量0.89 g/L、发酵温度32℃，实际测定值（10.492 3± 0.086 3）mg/100 mL，与理论预测值10.464 5 mg/100 mL相近，相对误差为0.27 %，说明真实值和预测值拟合效果较好。试验验证表明，回归模型可以较好地用来指导和预测红参液的发酵。

参考文献：

[1]李卓艳,李德坤,周大铮,等.正交试验法优选红参加工工艺[J].中成药,2011, 33(6):1005-1007

[2]李向高,郑毅男,张连学,等.田七素在加工红参中的变化及其转化机理[J].吉林农业大学学报,2005,27(4):405-407

[3]黄海英.人参皂苷Rg1药理作用研究进展[J].实用中医药杂志, 2012,28(7):608-609

[4]黄世敬.人参抗抑郁研究进展[J].时针国医国药,2014,25(1):175-177

[5]丁艳芬,李江霞,杨崇仁.人参皂苷Rh1的药理作用研究进展[J].中国现代中药,2013,15(4):282-284

[6] Jian Jie, Hu Zhi-Fang, Huang Yuan. Effect of ginsenoside Rg3 on Pim -3 and Bad proteins in human pancreatic Cancer cell line PANC-1[J].Chin J Cancer,2009,28(5):461

[7]郭志廷,褚秀玲,付本懂,等.人参皂苷-Rh2抗肿瘤机理的研究进展[J].中国兽医科技,2005,35(9):742-745

[8]陈林军,王莹,蔡东联,等.人参皂苷Rg1与1,6二磷酸果糖配伍抗疲劳作用的研究[J].氨基酸和生物资源,2010,32(4):58-62

[9]赵方允,陈自宏,虞泓,等.微生物转化人参皂苷研究进展[J].中国医药生物技术, 2010, 5(3): 216-219

[10] PARK CS,YOO MH, NOH KH, et al. Biotransformation of ginsenosides by hydrolyzing the sugar moieties of ginsenosides using microbial glycosidases[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87(1): 9-19

[11]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版社,2005: 7-8

Optimization of Fermentation Conditions on the Red Ginseng Saponin Content by the Response Surface Methodology

LI Shan-ji，DU Lu-ping，BAI Xue-song，GE Hong-juan，LIANG Cheng-wu*
（Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：To explore the effects of different fermentation conditions，namely，the fermentation time，yeast inoculation quantity，fermentation temperature，on the total content of saponin Rg1，Re，Rb1 on red ginseng. And based on the single factor experiment and using the response surface analysis of Box-Behnken（BB）experimental design to optimize the fermentation conditions. The results showed that The fermentation temperature，fermentation time，yeast inoculation quantity has an effect on the total saponin content of red ginseng and the order of effect as follows：fermentation temperature> fermentation time> yeast inoculation quantity. The optimum process was as follow：fermentation time was 41.80 h，yeast inoculation quantity was 0.89 g/L，fermentation temperature was 32.20℃，Under the optimal process conditions，the total saponin contents was increased 30.46 %.

Key words：red ginseng；total saponin；response surface analysis；yeast

收稿日期：2015-09-02

*通信作者：梁承武（1968—），教授，博士。

作者简介：李善姬（1969—），女（朝鲜），副教授，博士，研究方向：食品营养。

基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究（吉教科合字2015 第400）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.031