张文泉，邓 洁，任 峻

（凯里学院，贵州凯里556011）

珍稀濒危植物异形玉叶金花愈伤组织的诱导

张文泉，邓 洁，任 峻

（凯里学院，贵州凯里556011）

为珍稀濒危植物异形玉叶金花种质资源的繁殖、保存与利用提供依据，以幼嫩叶片为外植体，采用L16（45）正交试验设计研究不同浓度2，4－D、6－BA、暗培养时间及叶片划痕数等因子对异形玉叶金花叶片诱导愈伤组织的影响。结果表明：各因素对愈伤组织诱导率的影响依次为2，4－D＞暗培养时间＞6－BA＞划痕数；异形玉叶金花叶片诱导愈伤组织各因素最佳组合为1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA，划痕数5～7条，暗培养20d。该条件下愈伤组织的诱导率达91.6%。

异形玉叶金花；叶片；愈伤组织；诱导率

异形玉叶金花（Mussaenda anomala Li）为茜草科（Rubiaceae）玉叶金花属珍稀种［1－2］，1936年在广西大瑶山首次发现，1999年8月4日国务院批准为一级重点保护野生植物。2004—2006年，邓小芳等多次到广西大瑶山进行考察均未发现异形玉叶金花；在贵州黔南经多次调査及样地资料分析后确认，异形玉叶金花在贵州分布区的植株总数不超过60株。由于许多原有分布地点已找不到野生植株，也未发现新的分布地点，加之其种子自然更新能力较差，且易受虫害，目前全国总数不超过100株，因此，异形玉叶金花极为稀少而成为一个非常珍稀的濒危物种［3－4］。

通过组培途径实现植株再生不仅可以解决无性繁殖的问题，而且可以作为濒危植物种质资源保存的理想试验体系。以幼嫩叶片为外植体进行组织培养，可为单属种植物或珍稀濒危植物的保护提供一条重要途径，因为叶片来源广泛又不破坏母株。我国特有的珍稀植物蒙古黄榆（Ulmus macrocarpa var.mongolica）、金花茶（Camellia nitidissima Chi.）和膝柄木（Bhesa sinica）等均通过叶片为外植体获得了愈伤组织或建立了完整的植株再生体系［59］。迄今为止，国内外尚未有对异形玉叶金花进行组织培养的研究报道，因此对异形玉叶金花叶片诱导愈伤组织进行研究，可为建立异形玉叶金花植株再生的试验体系奠定基础。鉴于此，笔者于2015年采用植物组织培养方法对异形玉叶金花愈伤组织的诱导及分化进行研究，旨在为异形玉叶金花的回归种植，种质资源迁地保护等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 植物选取叶龄25d左右的嫩叶为外植体，采自黔东南州林业科学院温室大棚的异形玉叶金花当年生扦插苗。

1.1.2 试剂2，4－D，6－BA，0.1%氯化汞（HgC12），75%酒精，蔗糖，琼脂，MS（基本培养基）的各种元素。

1.2 试验方法

1.2.1 材料消毒采回的嫩叶于实验室中用毛刷擦拭表面后，流水冲洗3h。在超净工作台上，先用75%酒精消毒30s，无菌水冲洗3～5次，再用HgC12消毒10min，无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸干，将叶片分割成约1.5cm2的小片，备用。

1.2.2 试验设计试验采用4因子4水平的L16（45）正交试验设计。即：A，2，4－D（0.5mg／L，1.0mg／L，2.0mg／L，3.0mg／L）；B，6－BA（0.3 mg／L，0.5mg／L，0.8mg／L，1.0mg／L）；C，划痕数［密（5～7条），疏（4～5条），稀（1～2条），零划痕］；D，暗培养（5h，10h，15h，20h）。在MS基本培养基中添加3%蔗糖＋6.0g／L琼脂＋不同浓度激素，pH 5.8～6.0备用。外植体接种后暗培养5～20d，转入光照培养时其光照强度为1 500lx，时长为全天，用日光灯连续光照培养，温度保持（25±1）℃。

1.2.3 测定内容将消毒后的叶片用手术刀在背面划痕，背面与培养基接触的方式接种于不同处理培养基中，然后置于光照培养箱中按试验设计培养。试验共16组处理，每处理接种32个外植体，3次重复。接种后每隔5d观察1次愈伤组织的诱导情况，接种25d后，统计愈伤组织诱导率，分析不同条件对异形玉叶金花叶片诱导愈伤组织的影响。

愈伤组织诱导率＝（产生愈伤组织的外殖体数／接种外殖体总数）×100%

平均诱导率＝［（重复1诱导率＋重复2诱导率＋重复3诱导率）／3］×100%

1.3 数据统计与分析

采用Excel进行数据统计；采用SPSS 18.0软件，通过单变量多因素方差分析，比较各因素对愈伤组织诱导率的效应。

表1 异形玉叶金花叶片愈伤组织诱导试验各因素水平Table1 Factors and levels of the orthogonal test for callus induction of M.anomala

表2 不同处理异形玉叶金花叶片愈伤组织的诱导率Table2 Callus induction rate of M.anomalaleaves under different culture conditions

图示异形玉叶金花叶片愈伤组织的诱导培养Fig. Callus induction of M.anomalaleaves

2 结果与分析

2.1 不同处理异形玉叶金花叶片愈伤组织的诱导培养以异形玉叶金花幼嫩叶片作为外植体，接种培养3d左右叶片局部膨大，10d后均能得到愈伤组织，但愈伤组织出现的时间早晚不一，最早的6d时肉眼可见愈伤组织产生。从图示可见，16组试验所得到的愈伤组织由于形态不同可划分为2种类型：I型为乳白色，光滑致密，形如小米粒状，直径约为5～7mm；II型为淡黄色，疏松，形如水渍，直径为2～3mm。

2.2 不同处理异形玉叶金花叶片愈伤组织的诱导率

观察发现，划痕密的外植体出现愈伤组织的时间较早，较密划痕（5～7条划痕）的外植体在培养第7天时出现愈伤组织，而零划痕的外植体出现愈伤组织的时间较晚，在培养10d后才出现愈伤组织。从表2可见，接种25d后，各处理均有愈伤组织产生，但愈伤组织诱导率各不相同。受激素浓度、划痕数及暗培养时间等因素的影响，处理3、处理4、处理7～10和处理12～14愈伤组织的诱导率均超过70%，其中，处理9的诱导率最高，为91.6%，即当激素浓度为1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA组合，暗培养时间20d，划痕数5～7条时，愈伤诱导率最大。

2.3 各因素对愈伤组织诱导效应的检验

由表3可知：2，4－D、6－BA、划痕数目和暗培养4个因素的伴随概率p（Sig.）均小于0.05，说明，4个因素对异形玉叶金花愈伤组织的诱导率均存在显著影响；各因素对愈伤组织诱导率的影响依次为2，4－D＞暗培养时间＞6－BA＞划痕数。其中，2，4－D影响最大，影响最小的是划痕数。

2.4 暗培养处理愈伤组织的诱导率

暗培养时间4水平的愈伤组织诱导率均值分别为水平1（暗培养5d后光照培养20d）65.43%，水平2（暗培养10d后光照培养15d）72.9%，水平3（暗培养15d后光照培养10d）73.775%，水平4（暗培养20d后光照培养5d）74.975%。由表4可知，暗培养水平4与水平1、水平2、水平3之间的愈伤组织诱导率存在显著差异，水平1与水平2差异不显著。所以延长暗培养时间，可明显提高异形玉叶金花愈伤组织的诱导率。

2.5 植物生长调节剂处理愈伤组织的诱导率

该试验植物生长激素采用生长素2，4－D和分裂素6－BA。其中：1）2，4－D各水平愈伤组织诱导率的均值分别为水平1（2，4－D，0.5mg／L）66.65%，水平2（2，4－D，1.0mg／L）70.83%，水平3（2，4－D，1.5mg／L）79.1%，水平4（2，4－D，2.0mg／L）65.43%。由表5可知，2，4－D水平1、水平2、水平3和水平4之间的愈伤组织诱导率均存在显著性差异。由此可知，1.5mg／L2，4－D为最佳处理浓度。

表3 各因素对愈伤组织诱导效应的检验Table3 Test of different culture conditions for callus induction effect of M.anomala

表4 暗培养处理异形玉叶金花叶片愈伤组织诱导的差异性Table4 Difference in callus induction of M.anomalaleaves under dark culture treatment

表5 2，4－D处理异形玉叶金花叶片愈伤组织诱导的差异性Table5 Difference in callus induction of M.anomalaleaves under 2，4－DTreatment

表6 6－BA处理异形玉叶金花叶片愈伤组织诱导的差异Table6 Difference in callus induction of M.anomalaleaves under 6－BA treatment

2）分裂素6－BA各水平愈伤组织诱导率的均值分别为水平1（6－BA，0.3mg／L）71.85%，水平2（6－BA，0.5mg／L）70.83%，水平3（6－BA，0.8mg／L）70.81%，水平4（6－BA，1.0mg／L）69.8%。由表6可知，6－BA水平1与水平2、水平3、水平4之间的愈伤组织诱导率在0.05水平上均存在显著性差异，水平2、水平3和水平4之间的愈伤组织诱导率在0.05水平上无显著性差异。表明，低浓度分裂素可促进愈伤组织生长。由此可知，6－BA浓度0.3mg／L为最佳的浓度。

2.6 不同划痕数处理愈伤组织的诱导率

划痕数4水平的愈伤组织诱导率均值分别为水平1（0条，无划痕）63.55%，水平2（1～2条）65.43%，水平3（4～5条）74.95%，水平4（5～7条）78.10%。从表7可见，划痕数水平1、水平2、水平3和水平4之间的愈伤组织诱导率存在显著性差异。其中，较密的划痕（4～5条）能促进愈伤组织的诱导率。

表7 划痕数处理异形玉叶金花叶片愈伤组织诱导的差异性Table7 Difference in callus induction of M.anomalaleaves under scratch number treatment

综上所述，影响愈伤组织4因素的最佳组合是：1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA，划痕较密（5～7条划痕），暗培养20d后再光照培养5d。

3 结论与讨论

该试验结果表明，异形玉叶金花也能通过组织培养方式实现种群繁殖与保护。

植物生长调节剂调控细胞分化和生长的方向与进程，且仅以较低浓度产生各种特殊的调控作用。其种类、浓度及不同组合是影响植物组织培养的重要因素。2，4－D与6－BA是最常用的生长素类和细胞分裂素类植物生长调节剂，二者组合常用于愈伤组织的诱导。图亚等［8］研究发现，在MS培养基中添加0.2mg／L 6－BA＋1.5mg／L 2，4－D用于蒙古黄榆的组织培养，愈伤组织诱导率高达91.6%以上；DALILA Z D等［10］研究发现，MS＋1.5mg／L 2，4－D＋0.5mg／L 6－BA用于玉蕊（Barringtoniaracemosa）叶片愈伤组织培养，其诱导率为100%。莫竹承等［7］研究认为，MS＋1.0mg／L 2，4－D＋0.5mg／L 6－BA为膝柄木叶片愈伤组织诱导的最佳激素组合。诸多研究报道表明，愈伤组织诱导过程中，低浓度激素促进愈伤组织产生，不同激素的组合，不同浓度调配直接影响外植体的脱分化，甚至起决定性作用；2种激素并用充分体现出组合的优势［12］。与众多研究［812］结果一致，异形玉叶金花叶片愈伤组织诱导的最佳培养基及激素组合为MS＋1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA。

Kintzios S等［13］对Salvia officinalis和S.fruticosa的组培研究结果表明，黑暗的环境能促进愈伤组织产生，而且较低的光密度有助于胚性愈伤组织形成体细胞胚诱导形成。郭君丽等［14］研究发现，全光照条件下怀山药（Dioscorea opposita）叶片愈伤组织诱导率为50%～55%，如果先暗培养一段时间再光照培养，其诱导率达100%，且暗培养时间越长愈伤组织产量越大。林超等［15］认为，暗培养有利于白木香（Aquilaria sinensis）叶片外植体愈伤组织诱导。崔美等［1617］研究发现，先暗培养再光培养苹果Malus pumila等植物叶片的组培诱导率均达100%。

该试验结果表明，暗培养的时间延长有利于异形玉叶金花叶片愈伤组织的诱导，与Kintzios S等［1319］的研究结果一致。由此可知，暗环境有利于愈伤组织的产生。

对叶片增加划痕可以增加外植体与培养基的有效接触，促进外植体对营养物质及激素的吸收，从而能够促进细胞分裂与增殖。关于在叶片背面划痕促进愈伤组织诱导的报道非常少，具体的作用机理有待进一步研究。

在暗培养时间、划痕数目、2，4－D和6－BA等因素中，2，4－D对异形玉叶金花叶片愈伤组织诱导率的影响最大，其次是暗培养时间和6－BA，划痕数的影响最小。异形玉叶金花叶片组培诱导愈伤组织最佳条件是MS＋1.5mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA，叶背划痕数5～7条，连续暗培养20d再光照培养。

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（责任编辑：王 海）

Callus Induction of Mussaenda anomala，a Rare and Endangered Plant

ZHANG Wenquan，DENG Jie，REN Jun
（Kaili University，Kaili，Guizhou，556011，China）

The effect of 2，4－D，6－BA，dark culture days and scratch number on callus induction of young M.anomala leaves by L16（45）orthogonal test design to provide the basis for reproduction，conservation and utilization of rare and endangered M.anomalagermplasm resources.Results：The effect degree of four factors to influence callus induction rate is 2，4－D＞dark culture days＞6－BA＞scratch number.The optimal combination of four influence factors for callus induction of young M.anomalaleaves includes 1.5mg／L 2，4－D，0.3mg／L 6－BA，5～7scratches and dark culture for 20d.Under this condition，the induction rate of callus was 91.6%.

Mussaenda anomala；leaf；callus；induction rate

S567.1＋9；Q943.1

A

1001－3601（2016）10－0434－0102－05

2016－05－10；2016－10－08修回

贵州省科技厅联合基金项目“青钱柳愈伤组织诱导及植株再生研究”［黔科合LH字（2014）7241］；贵州省教育厅优秀科技创新人才项目“异形玉叶金花组织培养研究”［黔教合KY字（2014）251］；贵州省重点学科建设项目“生物学重点学科”［黔学位合字ZDXK（2015）23］；黔东南州科技计划项目“蓝莓愈伤组织诱导及植株再生研究”［黔东南科合J字（2014）4001］；凯里学院校级博士专项课题项目“南方红豆杉体细胞胚胎发生及调控因子的研究”（凯科合BS201338）

张文泉（1984－），男，副教授，从事林木生物技术方面的研究。E－mail：zwq840209＠yeah.net