王 超，郭雪玲，郭瑞军＊

（1.内黄县思源农业科技有限公司，河南内黄456300；2.安阳地区医院急诊科，河南安阳455000；3.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌712100）

基于ITS2和rbcL序列石斛属植物的鉴定

王 超1，3，郭雪玲2，郭瑞军1，3＊

（1.内黄县思源农业科技有限公司，河南内黄456300；2.安阳地区医院急诊科，河南安阳455000；3.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌712100）

为选育优质石斛品种和开发利用高效药用石斛资源，利用形态学分类法和DNA条形码技术对采集到的石斛样品进行鉴定，并对样品ITS2序列二级结构进行分析。结果表明：样品形态与石斛属植物特征相似。以ITS2序列构建系统发育树，样品GX07与Dendrobium loddigesii，YN08与Dendrobium officinale位于同一位置，其二级结构也基本一致，螺旋区和茎环等结构均无明显区别。基于rbcL序列构建的系统发育树没有达到很好的分辨效果，石斛属种间遗传距离最大为0.028。表明ITS2比rbcL更适合石斛属种间物种鉴定，并且其二级结构具有一定的辅助作用。

石斛属；ITS2；rbcL；二级结构

石斛属（Dendrobium）是兰科（Orchidaceae）最大的属之一，全世界范围内约1 500种，我国有74种和2个变种，其中多数为传统名贵中药［12］。铁皮石斛和美花石斛具有益胃生津、滋阴清热的功效，由于铁皮石斛具有广泛的保健作用，更是被视为石斛中的珍品［34］。石斛生长环境独特，对温度、湿度等自然条件要求较高，并且生长缓慢，人工种植难度大，成本高。过多依赖野生资源，使野生石斛遭到严重破坏，也导致医药市场上石斛商品来源混乱。准确鉴定对石斛品种选育及确保石斛药效具有重要意义，然而石斛属植物的形态特征有较大的相似性，给该属植物的鉴定工作带来极大困难。

DNA条形码（DNA barcoding）技术是一种利用标准的短的DNA片段来准确、快速地进行物种鉴定的新技术［5］。Chen SL等［6］通过对753属4 800种6 600余份样品进行序列分析发现，ITS2在种水平上的鉴定成功率高达92.7%。陈士林等［7］经过大量的工作研究，建立了以ITS2序列为主体的药用植物DNA条形码鉴定体系。ITS2二级结构在多种药用植物鉴别中得到应用，并且常被用作DNA条形码的辅助分析手段。rbcL基因是编码叶绿体中核酮糖－1，5－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Rubisco）大亚基的单拷贝序列，是植物分类中普遍应用的基因之一。为进一步选育优质石斛品种和开发药用石斛资源，笔者利用传统形态分类和DNA条形码技术对所采集的2个石斛属样品进行分类，并对其ITS2二级结构进行分析，以期准确鉴定石斛样品，通过比较各种鉴定方法的不同，为进一步优化石斛鉴定方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

石斛：采集自广西钦州（编号：GX07）和云南保山（编号：YN08），由内黄县思源农业科技有限公司提供。

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序

分别称取约150mg石斛放入预冷研钵中，加液氮充分研磨后，使用DNA提取试剂盒提取样品总DNA。参考文献［1］的方法设计ITS序列扩增引物，正向为5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG－3′，反向为5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′，扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min；参考文献［8］的方法设计rbcL序列扩增引物，正向为5′－ATGTCACCACAAACAG AGACTAAAGC－3′，反向为5′－GTAAAATCAAG TCCACCRCG－3′，扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物经纯化后，送上海英骏生物科技有限公司测序。

1.3 序列分析

［9］的方法，基于隐马尔可夫模型（Hidden Markov model）的注释方法，去除5.8S和28S区段以获得ITS2序列，将序列在NCBI网站上用Blast工具进行同源序列比对［10］。从GenBank下载部分同源序列，利用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）软件进行分析、处理［11］，用邻接法（Neighbor－Joining method）构建系统发育树，鉴定分析各样品。

2 结果与分析

2.1 形态鉴定

2个样品形态较为相似（图1），茎圆柱形，粗约0.3cm，具多节。样品GX07在茎节处长出侧芽，具气生根（图1－A）。样品YN08的叶呈长圆披针形，先端钝且有钩转，叶鞘具紫斑（图1－B）。根据2个样品的形态特征，将其初步鉴定为石斛属植物。花是被子植物重要的繁殖器官，能精确反应物种的分类学地位［12］。由于所采集样品尚未发育到开花阶段，所以很难进一步确定其分类地位。

图1 石斛样品的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of Dendrobiumsamples

2.2 PCR扩增及测序

由图2可知，样品GX07和YN08的PCR产物经凝胶电泳分析发现为单一条带，ITS扩增产物大小约750bp（图2－A），rbcL片段大小在500～750bp（图2－B），均与预期目的条带大小相符。

图2 石斛样品PCR产物电泳图谱Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of Dendrobiumsamples PCR products electrophoresis of Dendrobiumsamples

2.3 序列分析

大部分被子植物ITS区的GC含量约为50%［13］。通过比较2个样品的ITS2序列，GX07的ITS2序列长度为248bp，GC含量为52.42%，YN08略有不同，ITS2序列长度为246bp，GC含量为51.22%。2个样品的ITS2长度和GC含量均与栗丹等［14］测定的石斛样品结果相符合，且2个样品的rbcL测序长度接近，GX07样品中为568bp，GC含量为42.43%，YN08样品为567bp，GC含量为42.83%。

利用2个样品的ITS2和rbcL序列在GenBank数据库中分别进行Blast比对，结果显示GX07与Dendrobium loddigesii，YN08与Dendrobium officinale的相似度均≥99%。Landeweert R等［15］在研究中指出，序列相似度≥99%可认定为同一种，可以初步判定GX07为美花石斛（Dendrobium loddigesii），YN08为铁皮石斛（Dendrobium officinale）。

2.4 系统进化树分析

由图3可知，GX07与Dendrobium loddigesii，YN08与Dendrobium officinale位于进化树的同一位置，且遗传距离均为0.000，表明样品与同一位置的物种为同一种。然而在rbcL构建的进化树（图4）中，其并没有处于同一位置，遗传距离均为0.004，这可能与样品rbcL序列两端个别碱基测序准确度有关。

基于ITS2序列构建的进化树能很好地显示出所选样品间的差异，并且支持率较高，所选石斛属样品的种间遗传距离最大、最小值分别为0.283和0.053，而rbcL序列分析显示最大遗传距离、最小遗传距离分别为0.028和0.000，其中Dendrobium aduncum和Dendrobium gratiosissimum在进化树的同一位置，遗传距离为0.000，由此可知ITS2有较强的鉴别能力。

图3 基于ITS2序列的系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree based on ITS2sequence

图4 基于rbcL序列的系统进化树Fig.4 The phylogenetic tree based on rbcLsequence

图5 ITS2序列二级结构比较Fig.5 The comparisons of ITS2secondary structures

2.5 二级结构分析

从图5可知，GX07和YN08的二级结构均包含1个中心环（主环）和4个螺旋区（Helix），在每个螺旋结构上都有大小不等、数量不同的茎环结构（Loop）。GX07与Dendrobium loddigesii，YN08与Dendrobium officinale的二级结构相同，表明ITS2二级结构在相同物种间差别较小。比较2个样品的二级结构，在主环大小、茎环大小和位置方面均有较大区别，表明其在不同物种间具有较强的鉴别能力。

3 结论与讨论

ITS（Internal Transcribed Spacer）即内转录间隔区，被5.8S分为ITS1和ITS2两部分，在进化过程中受到的选择压力较小，进化速率较快。其中，ITS2序列片段较短、易扩增、通用性强，常被用于种和属水平的系统发育分析［16］。试验以纹瓣兰（Cymbidium aloifolium）为外类群，以包含样品在内的20条石斛属物种的ITS2序列构建系统发育树，发现GX07与Dendrobium loddigesii，YN08与Dendrobium officinale遗传距离为0.000，而种间遗传距离最小，为Dendrobium gratiosissimum和Dendrobium officinale之间的0.053，说明ITS2序列在石斛属种内差异小、种间差异大，与严华［17］和Lau DT［18］等的研究结果一致。然而Xu SL等［19］通过对石斛属184种的1 698条序列进行分析，确定ITS＋matK为最有效的条形码组合，而ITS2对166种664条序列的鉴定效率仅22.29%。

rbcL基因长约1 400bp，容易扩增和测序，其中，长500～600bp的片段被用作植物条形码，由于其进化速率慢，适合用于研究属及属以上单位的系统进化分析［20］。Xu SL等［19］的研究结果也证实了rbcL基因在石斛属种间的分辨效率很低。通过对rbcL基因序列进行分析发现，所选石斛属样品的种间遗传距离最大，为0.028，Dendrobium aduncum和Dendrobium gratiosissimum的遗传距离为0.000，表明rbcL基因不适合石斛属种间水平的鉴别。然而袁佐清等［21］通过rbcL基因序列构建的系统发生关系与经典的形态分类学结果基本一致。

石斛属植物外形特征相似，该属植物种类鉴定是兰科植物最困难的问题之一。随着生物技术的发展，DNA条形码技术能够快速准确地分辨物种，在植物鉴定中显示出独特的优势。然而DNA序列的选择极大影响了DNA条码的准确性，ITS2和rbcL序列能否使用还有待进一步试验验证。

［参考文献］

［1］李海霞.基于rDNA ITS序列分析的石斛属种内及种间鉴别［D］.广州：广州中医药大学，2012.

［2］周 红，马双姣，杨 培，等.基于DNA序列的石斛属药用植物鉴定研究进展［J］.世界科学技术－中医药现代化，2015（5）：950－957.

［3］吕圭源，颜美秋，陈素红.铁皮石斛功效相关药理作用研究进展［J］.中国中药杂志，2013，38（4）：489－493.

［4］白 音，包英华，王文全，等.美花石斛RAPD－PCR反应体系的建立［J］.时珍国医国药，2007，18（3）：521－523.

［5］LUO K，CHEN SL，CHEN K L，et al.Assessment of candidate plant DNA barcodes using the Rutaceae family［J］.Science China Life Sciences，2010，53（6）：701－708.

［6］CHEN SL，HUI Y，HAN J，et al.Validation of the ITS2region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species［J］.Plos One，2010，5（1）：e8613.

［7］陈士林，庞晓慧，罗 焜，等.生物资源的DNA条形码技术［J］.生命科学，2013（5）：458－466.

［8］KUZMINA M L，JOHNSON K L，BARRON H R，et al.Identification of the vascular plants of Churchill，Manitoba，using a DNA barcode library［J］.Bmc Ecology，2012，12（1）：1－11.

［9］KELLER A，SCHLEICHER T，SCHULTZ J，et al.5.8S－28SrRNA interaction and HMM－based ITS2 annotation［J］.Gene，2009，430（1）：50－57.

［10］张国广，卢文朋，林溜章，等.一株野生有柄树舌的鉴定、菌丝培养特性及驯化栽培［J］.北方园艺，2015（22）：153－157.

［11］TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al.MEGA6：Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0.［J］.Molecular Biology ＆Evolution，2013，30（4）：2725－2729.

［12］常鸿莉.毛茛科花形态发生和花变态及其系统学意义［D］.西安：西北大学，2005.

［13］LESKINEN E，ALSTR RAPAPORT C.Molecular phylogeny of Salicaceae，and closely related Flacourtiaceae：Evidence from 5.8S，ITS1and ITS2of the rDNA［J］.Plant Systematics ＆Evolution，1999，215（1／2／3／4）：209－227.

［14］栗 丹，李振坚，毛 萍，等.基于ITS序列石斛材料的鉴定及系统进化分析［J］.园艺学报，2012，39（8）：1539－1550.

［15］LANDEWEERT R，LEEFLANG P，KUYPER T W，et al.Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons［J］.Applied ＆Environmental Microbiology，2003，69（1）：327－333.

［16］ALVAREZ I，WENDEL J F.Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference［J］.Molecular Phylogenetics ＆Evolution，2003，29（3）：417－434.

［17］严 华，石任兵，姚 辉，等.铁皮石斛的ITS2条形码分子鉴定及5种重金属及有害元素的测定［J］.药物分析杂志，2015，35（6）：1044－1053.

［18］LAU DT，SHAW P C，WANG J，et al.Authentication of medicinal Dendrobium Species by the internal transcribed spacer of ribosomal DNA［J］.Planta Medica，2001，67（5）：456－460.

［19］XU SL，LI D Z，LI J W，et al.Evaluation of the DNA barcodes in Dendrobium（Orchidaceae）from mainland Asia.［J］.Plos One，2015，10（1）：e0115168.

［20］向小果，王 伟.植物DNA条形码在系统发育研究中的应用［J］.生物多样性，2015，23（3）：281－282.

［21］袁佐清，张建勇，刘 涛.石斛属植物rbcL基因序列变异和系统发育初步研究［J］.时珍国医国药，2009，20（7）：1836－1837.

（责任编辑：孙小岚）

Identification of Dendrobiumby ITS2 and rbcL Sequence

WANG Chao1，3，GUO Xueling2，GUO Ruijun1，3＊
（1.Neihuang Siyuan Agri－Tech.Co.，Ltd.，Neihuang，Henan 456300；2.Emergency Department，Anyang District Hospital，Anyang，Henan 455000；3.College of Life Sciences，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）

To breed high－quality varieties and develop resources of Dendrobium，the collected samples were identified by morphological determination and DNA barcoding method，anDThe ITS2secondary structure was predicted and analyzed.The results showeDThe morphology of the samples was similar to that of the genus Dendrobium.The phylogenetic tree based on ITS2sequence showeDThat GX07and Dendrobium loddigesii，YN08and Dendrobium officinale were located at the same position with nearly identical ITS2secondary structures.There was no significant difference in structures including Helix and Loop.However，the maximum genetic distance between genus Dendrobiumwas 0.028，without a very good resolution effect of the phylogenetic tree based on rbcLsequence.The results indicateDThat ITS2sequence may be more effective in the identification of different species of Dendrobiumwith its secondary structure playing a supportive role.

Dendrobium；ITS2；rbcL；secondary structure

R282.5

A

1001－3601（2016）10－0410－0001－04

2016－06－14；2016－10－05修回

王 超（1990－），女，从事植物系统进化研究。E－mail：zhoumo＠nwsuaf.edu.cn

＊通讯作者：郭瑞军。E－mail：guo＿2009＿2013＠nwsuaf.edu.cn。