杨 洁 曹玉锦

(山东省枣庄市薛城奚仲中学 277000)(中国科学院青岛生物能源与过程研究所 266101)

2016年5月2日，生物学领域顶尖刊物《自然-生物技术》发表了我国河北科技大学韩春雨等的研究成果《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》[1]，该论文提出一种新的基因组编辑技术NgAgo-gDNA。

1 什么是基因组编辑技术

基因组编辑技术(genome editing)是指对基因组进行定点修饰的遗传操作技术[2]。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，实现对特定DNA片段的敲除、插入等操作。该技术通过在特定的靶向序列处引入断裂的DNA双链，继而利用细胞自身的修复机制完成修复，从而达成修改并编辑原有的基因组的目的。与传统的同源重组技术和胚胎干细胞技术相比，基因组编辑技术具有快速、操作便捷、成本较低等优势，为基因治疗、生物遗传改造等领域开辟了新的途径。

基因组编辑技术迄今为止仅有20年左右的历史，但在近十年取得突破性进展，目前已提出的基因组编辑策略包括ZFN技术、TALEN技术、CRISPR/Cas9技术以及本文着重介绍的NgAgo-gDNA技术。

2 新一代基因组编辑技术——NgAgo-gDNA

NgAgo-gDNA是Natronobacterium gregoryi Argonaute - guide DNA的简称，Natronobacterium gregoryi是格氏嗜盐碱杆菌；Argonaute(Ago)是一种核酸内切酶；gDNA 即向导DNA。2004年，荷兰学者发现来自嗜热菌的Ago可以有效地利用5′磷酸化的单链DNA作为gDNA，对基因组进行定点切割造成其双链断裂[2](但该酶需要在>65°C的条件下才具有活性，限制了其在生物体中应用的可能性)。韩春雨课题组在此基础上，通过数据库比对，找到了来自格氏嗜盐碱杆菌的Ago(NgAgo)，该蛋白在生理条件下即具有很好的酶切活性，可以在多种哺乳动物细胞中实现gDNA介导的基因组的切割(图1)，并且能够实现在基因组中插入目的DNA片段的能力，是一种高效快捷的基因组编辑工具[1]。

根据韩春雨课题组的研究结果，NgAgo-gDNA与CRISPR/Cas9技术相比具有以下特点：①向导设计制作简便：gDNA设计方便，可以像合成PCR引物一样由公司合成，输送方式直接，直接转染细胞：②编辑对象所受限制小：Cas9需要与基因组上19个碱基配对，并要求在这组碱基后紧邻一个特定的PAM序列，一定程度上限制了靶位点的选择范围，而NgAgo-gDNA技术中靶位点的选择则不受PAM序列的限制，几乎能编辑基因组内任何位置；③编辑精准度更高：与NgAgo结合的gDNA长度为24个碱基，这比与Cas9结合的19个碱基的gRNA要长5个碱基，理论上其精确性可以提高45倍；NgAgo-gDNA系统对gDNA靶序列错配容忍度很低；同时，向导核酸是DNA而非RNA，避免了RNA形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应。与CRISPR/Cas9技术相比，目前NgAgo-gDNA的劣势在于：①无法使用质粒或慢性病毒载体输送gDNA；②gDNA不能再改造，而gRNA可以连接一段RNA不影响功能。

图1 NgAgo-gDNA技术原理示意图

3 NgAgo-gDNA技术的启示

NgAgo-gDNA是我国学者首创的尖端生物技术，被誉为第四代基因组编辑技术，打破了国外基因组编辑技术的专利垄断。但该技术还需要后续工作进行验证和进一步的改进。