李蕊蕊，赵新节，孙玉霞

1(山东省农业科学院农产品研究所，山东 济南,250100) 2(齐鲁工业大学，山东省微生物工程重点实验室，山东 济南,250353)



葡萄和葡萄酒中单宁的研究进展

李蕊蕊1,2，赵新节2，孙玉霞1*

1(山东省农业科学院农产品研究所，山东 济南,250100) 2(齐鲁工业大学，山东省微生物工程重点实验室，山东 济南,250353)

摘要单宁是葡萄与葡萄酒中重要的酚类物质，对葡萄与葡萄酒的品质有着重要的影响。该文介绍了单宁的概念与分类，单宁在葡萄果实中的存在形式及其在果实成熟过程中的变化，单宁在葡萄酒中的存在形式及其在葡萄酒酿造过程中的变化，以及单宁的提取、分析、检测方法等方面的研究进展，并提出了今后的研究方向。

关键词单宁；葡萄；葡萄酒；分析

单宁又名单宁酸，在药典上又称鞣质、鞣酸，是一类由一些非常活跃的基本分子通过缩合或聚合作用形成的复杂的高分子多元酚类化合物[1]。单宁是葡萄果实中最丰富的酚类物质，主要存在于葡萄的果皮、种子、果肉和果梗中，不仅直接地影响葡萄酒的色泽、风味、品质、稳定性和陈酿潜质，而且单宁在葡萄酒中还有沉淀蛋白质、提高结构感、抗氧化、抗自由基、稳定色素、抗菌、防止还原味和光味的作用，是组成红葡萄酒涩味的重要成分[2-3]。因此，对酿酒葡萄及葡萄酒中单宁的研究极为重要。

1单宁的概念与分类

植物单宁是植物的次生代谢产物。1962年Bate-Smith将单宁定义为：能沉淀生物碱、明胶及其它蛋白质，相对分子质量为500～3 000的水溶性多酚化合物[19]。常温下单宁为淡黄色至浅棕色粉末，有特殊气味，味极涩。溶于水、丙酮、乙醇，不溶于乙醚和氯仿。容易吸潮，在空气中易氧化使其颜色加深，本身毒性很低[20]。植物单宁的各种性质，包括自由基清除能力和蛋白质结合能力等主要取决于化学结构特征特别是聚合度的大小[21]。根据单宁化学结构的不同，植物单宁通常可分为水解单宁和缩合单宁[22～23]。

水解单宁，是由酸及其衍生物与葡萄糖或多元醇通过酯键形成的化合物，容易被酸或酶水解为糖、多元醇和酚性羧酸[24]。这类单宁主要包括葡萄糖的联苯三酚酯(所谓的棓单宁)和鞣花酸(鞣花单宁和单宁配合物)的酯。因为含有酯键，它们被称为“可水解的”[16]。葡萄酒中的水解单宁主要来自于橡木桶陈酿或酿酒过程中添加外源性单宁[25]。

缩合单宁主要来源于葡萄种子和果皮，是黄烷-3-醇聚合物，通常是由一类黄烷-3-醇及黄烷-3,4-二醇结构单元通过C4→C8(或C4→C6)键缩合而形成的寡聚或多聚物[16,23,26]。它包括儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素或连接在黄烷醇C4-C8键的表儿茶素没食子酸[27-28]。在葡萄和葡萄酒中发现的黄烷-3-醇单体主要是(+)-儿茶素，(-)-表儿茶素和(-)-表儿茶素-3-o-没食子酸酯[29]。在大多数典型的红葡萄酒中。单体黄烷-3-醇类的质量浓度为40～120 mg/L的范围内(以儿茶素计)[30]。

2葡萄果实中的单宁

2.1单宁在葡萄果实中的存在形式

在葡萄浆果中，构成单宁的聚合多酚主要分为儿茶素和原花色素两类。单宁主要存在于葡萄的果皮、种子和果梗中[31]，果皮中单宁含量低于种子，其组成也有所不同[28]。果皮中的单宁主要存在于液泡中，在接近表皮细胞处密集成群，其颗粒一直扩散到中果皮，因此厚壁细胞又被称为“单宁细胞”[32]。且单宁与液泡膜有非常强烈的结合，不受超声的影响[33]，部分单宁结合在纤维素果胶壁上。种子中的单宁主要在种子的外部，来保护内部的胚胎，只有角质层被溶解时它才会被释放出来[34]。单宁在果皮中含量为0.5%～4.0%，种子中的含量为2.2%～8.0%，一般占果实中单宁总含量的50%以上[35]，果梗中的含量为1%～5.4%[3]。葡萄种子中单宁由(+)-儿茶素，(-)-表儿茶素，(-)-表儿茶素没食子酸酯和原花青素P2-P9的多分子链构成，包括1到3个没食子酰基。一方面，这些大分子没食子酰基有强烈的紫外吸收，导致其在280 nm处有最大吸收。另一方面，基本分子和二聚体的含量大约为500 mg/L，,这些聚合物分子的平均聚合度(MDP)至少为10。葡萄果皮中单宁主要包括(+)-儿茶素，(-)-表儿茶素，(+)-没食子儿茶素，(-)-表没食子儿茶素，这些原花青素分子没有较高的没食子酰化，含量约为20 mg/L，其余部分包括一些聚合或缩合的生物大分子，MDP约为30。果梗中多为聚合的单宁，非胶体原花青素，与种子中单宁反应特性相似。MDP约为9[36]。种子单宁中棓酸化分子占21%～40%，高于其在果皮(3%～10%)和果梗(14%～21%)中的比例，而果皮中三羟基分子的比例(10%～30%)则明显高于果梗(1%～6%)[3]。

2.2葡萄果实成熟过程中单宁的变化规律

葡萄成熟过程中，果皮单宁含量增加，种子单宁含量减少[15,36]。果皮中单宁的结构较为复杂，其聚合度变化不大。在颜色变化过程中，其二聚体和三聚体含量很低，在成熟过程中几乎没有下降，HCL指数相对恒定(12～15)。这些分子具有胶体特性，随着成熟，它们变的越来越少，明胶指数降40%，透析指数从35降低至25。单宁在葡萄果实成熟过程中收敛性逐渐降低。随着葡萄果实成熟，转色后种子中单宁含量减少，其减少的程度依成熟状况有所不同，并且与花青素的积累相关。然而，在某些情况下，种子单宁在颜色刚开始变化时迅速减少，在成熟过程中变化平稳。种子中单宁的变化还与葡萄品种相关，有些品种单宁含量较低(赤霞珠)，然而有些品种有较高的单宁含量(品丽珠，黑品诺等)。在葡萄成熟及浆果变化过程中，果梗中单宁含量都很高。在白葡萄品种中也是同样的现象：果皮中单宁积累，种子中单宁降低[36]。

3葡萄酒中的单宁

3.1单宁在葡萄酒中的存在形式及其作用

单宁在葡萄酒中具有：沉淀蛋白质，提高结构感，稳定色素，抗氧化，抗自由基，抗菌、防止还原味和光味的作用[3]。小分子聚合单宁具有与蛋白质或其他聚合体结合的特点，单宁与水溶性蛋白质结合时，使其沉淀。在口腔中单宁与唾液中引起超收敛性的糖蛋白结合反应，令人产生涩味的感觉，这种能力称为收敛性。单宁与蛋白质结合产生收敛性与单宁的分子量有关，单宁的分子量小于500 Da时，结合蛋白质的能力低，而分子量大于3 000 Da时，基本上也没有结合蛋白质的能力，只有分子量在500～3 000 Da之间时，才随着酚羟基数目的增多，结合蛋白质的能力逐渐增强[37-39]。葡萄酒中起收敛作用的缩合单宁主要是由儿茶素、表儿茶素和原花色素形成的低聚合单宁，同时收敛性强弱又与聚合度、分子结构密切相关。葡萄中所含单宁数量、种类对葡萄酒口感、结构、风味以及营养价值具有重要影响[40]。且单宁具有抗氧化性，能够防止红葡萄酒在陈酿过程中变坏。单宁含量是影响葡萄酒颜色的重要因素[25]。葡萄酒的颜色一般与单宁含量正相关[4,41]。

果皮中单宁比种子中的圆滑柔和，酿酒时应合理调配两种单宁进入酒中的比例[5]。在任何情况下，优质葡萄酒的特点都是种子与果皮中单宁的平衡。

3.2葡萄酒酿造过程中单宁的浸提及影响因素

在酿酒过程中，单宁主要在3个阶段进入酒中：1)浸渍发酵之前，一般时间相对较短(数小时至数天)，是酒精发酵前的一个时期。2)酒精发酵过程中持续浸泡数天，通常为2～7 d，依情况而定。3)发酵后的浸泡，在酒精发酵后和一些酒的陈酿。它的长度是可变的，从几天到几个周[36]。

葡萄果实中单宁含量与酒中单宁含量没有一定的关系，酒中单宁的含量还与酿酒过程中单宁的提取密切相关[35]。酿酒工艺对单宁浸提的影响主要在以下方面：酶处理[42]，皮渣接触[43]，发酵温度[44-45]，葡萄品种和成熟度、原花青素含量、浆果破碎程度、热处理、二氧化碳浸渍、果胶酶、浸渍时间、葡萄酒中乙醇含量等的影响[45-46]。在浸渍过程中果皮单宁被浸提，主要为花青素，细胞壁破碎后，使液泡的内容物被提取[47]。缩合单宁与细胞壁的结合很大程度上受单宁性质的影响，相互作用的强度和程度主要取决于单宁的相对分子量、构象柔性、酰基聚合程度和单宁的立体化学[48-49]。粥化酶可以破坏单宁与细胞壁的结合，促进葡萄果皮和种子中单宁的释放，进而增加葡萄酒中单宁[50-51]。发酵前低温浸渍可以增加酒中葡萄籽单宁等酚类物质含量[5]。增加色素和果皮中香气进入酒中[47]。关于乙醇对单宁提取的研究发现：乙醇浓度为13%vol时对单宁的提取效果显著高于6.5%或0%[52]。GONZALEZ-MANZANO等研究在模型酒中增加酒精度对原花青素单体和低聚体的提取发现，黄烷-3-醇含量随酒精含量的增加而增加，浸渍24 h后12.5%乙醇中含量最大[53]。酒精发酵过程中，酵母种类也影响葡萄酒的组成。例如，酵母释放的甘露糖蛋白可以加速单宁与花青素反应[54]。此外，酵母产生的乙醛可以参与形成花青素-乙醛-黄烷-3-醇衍生物，有利于提高苦味、收敛性和酒的颜色[55]。商品单宁的主要成分是缩合单宁[56]，广泛应用于葡萄酒酿造。一些研究通过向酒中加入橡木片来提供单宁，加速酒的老化[57]，改善葡萄酒结构[58]，保护内源性单宁，防止氧化，防止发生还原味[59]。葡萄酒在橡木桶中陈酿的过程中，被赋予了来自橡木桶的特殊风味，并促进了单宁分子之间的聚合，使酒体变得柔和、圆润。

4单宁的分析与检测方法

4.1单宁的提取、分离与纯化

单宁提取时样品的状况如样品的贮藏、干燥和提取条件都可能导致其提取率和单宁组成结构的变化，从而导致单宁的化学、物理和生理活性发生改变。影响单宁提取的因素主要有样品的粉碎程度、溶剂的种类、样品与溶剂的料剂比、温度、时间以及提取次数等。单宁样品提取前需经粉碎成为粉末。通常较细的粉末有利于单宁提取，但是由于粉粹时间的过长，导致单宁氧化变性，过细时单宁的提取量反而减小，最适合的尺寸是100目左右[60]。单宁的提取方法种类繁多，有温水浸提法、有机溶剂提取法、超临界流体萃取法、超声波法、膜技术、微波法等。其中溶剂提取法最为普遍。水是单宁的良好溶剂，但有机溶剂和水的混合体系使用更为普遍，使用的有机溶剂主要包括乙醇、甲醇、乙醚、丙醇、乙酸乙酯等。由于单宁是极性很强的水溶性酚类化合物，丙酮水溶液对单宁的溶解能力很强，能打开单宁-蛋白质间的连接键，因而使单宁的提取率提高[61]，同时减压蒸发易除去丙酮[21]。有相关的研究表明，加少许的水比纯丙酮溶液对单宁的提取量要高，可显著改善单宁提取效果，即可促进结合态单宁的溶解，又可减少单宁在长时间保温提取过程中的降解和变质[62]。丙酮水溶液是目前使用最普遍的溶剂体系[17，63]。

单宁的粗提物中含有大量的糖类、蛋白质、酯类等杂质，另外单宁本身是许多结构和理化性质十分接近的混合物，因此需要进一步的分离纯化。通常使用有机溶剂分步萃取的方法对单宁进行初步的纯化，如甲醇可以使水解单宁中的缩酚酸键发生醇解，乙醚只溶解相对分子质量较小的多元酚类，乙酸乙酯可以溶解多种水解单宁及低聚的缩合单宁。对单宁的初步分离还可以采取皮粉法、渗析法、醋酸铅沉淀法、结晶法、超滤法和氯化钠盐析法等[21,64]。柱色谱是目前制备纯单宁及有关化合物的最主要方法，可选用的固定相有硅胶、纤维素、聚酰胺、聚苯乙烯凝胶、聚乙烯凝胶、葡聚糖凝胶等，其中又以葡聚糖凝胶Sephadex LH-20最为常用[65-66]，其他一些色谱方法如薄层色谱、纸色谱、离心分配色谱等也有应用于单宁提取的报道。

4.2单宁的定量分析

单宁的结构比较复杂，因此对单宁的研究比较困难。目前虽然有多种研究单宁的定量分析方法，但是这些方法都是相对的没有选择性的，而且不能同时对所有的酚类做出分析。几乎没有一种可以适用于各种植物样品的测定。

整体上，单宁的定量分析方法可以分为3类：基于生物作用的方法、常规方法和色谱法。基于生物作用的方法主要有蛋白质沉淀法。常规方法主要包括盐酸-正丁醇法、香草醛法、皮粉法、亚硝酸钠法和比色法(普鲁士蓝法、Folir-Denis法)等。色谱法主要包括尺寸排阻色谱法和反相高效液相色谱法[67]。在实际的研究工作中，需要依据具体的实验目的和要求选择合适的定量分析方法。当测定由单宁收敛性所带来的生物活性及相关特性时，可采用蛋白质单宁沉淀法。由于酿酒葡萄与葡萄酒中单宁可与口腔唾液蛋白结合发生反应，蛋白质单宁沉淀法较为适用。同时，蛋白质沉淀法操作简单，易于掌控，方便快捷，非常适合实验操作。此方法是基于牛血清蛋白和碱性磷酸酶的共沉淀作用，碱性磷酸酶沉淀的数量显示与出现的单宁的数量呈比例，因此能直接被检测出来[35]。利用单宁和蛋白质产生的沉淀反应分离提纯单宁，再将单宁溶解使其与显色剂作用发生显色反应，其颜色的深浅与单宁的含量呈正相关，并在510nm波长下有最大吸收。且吸光值与单宁含量在一定浓度范围内呈线性关系[24]。测定植物样品中的单宁含量，可采用Folin-Denis法和普鲁士蓝法；如测定缩合单宁的含量，可以采用盐酸一正丁醇法和香草醛法。

4.3单宁的结构分析

由于单宁是由不同长度和4种可能的亚基构成，单宁的结构千差万别，因此对单宁的结构分析比较困难。在葡萄单宁中，有15种亚基，虽然由C4-C8键连接，但仍然有105种独特的化学结构[35]，对单宁结构的分析十分的困难。但是，单宁复杂的结构影响单宁分子与各种大分子间的相互作用，特别是单宁聚合度可影响单宁与人体唾液蛋白之间的相互作用，从而影响红葡萄酒的感官特性[49,68]，因此对酿酒葡萄与葡萄酒中单宁结构的分析特别是单宁聚合度的分析十分的重要。近年来对葡萄及葡萄酒中单宁聚合度的分析主要采用液相色谱法和液相色谱质谱连用的方法[12,69]

分析植物单宁结构的方法有多种，根据原理可分为4大类：1是化学分析方法；2是色谱分离技术的分析方法；3是波谱法：4是质谱分析法。高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱(TLC)技术可以用于鉴定样品中所含单宁的结构类型；质谱(MS)及核磁共振(NMR)技术可对植物单宁的纯化物进行结构测定；基质辅助激光解析离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱技术可对植物单宁混合物进行结构分析，并且此方法被证明是一种分析多分散的植物单宁聚合物的最为理想的方法[70]。ADELINE等用UHPLC-ESI-Q-ToF法对葡萄酒中原花青素裂解途径进行了研究[71]。

5展望

由于单宁的结构复杂，分析比较困难，且其结构影响单宁分子与各种大分子间的相互作用，进而影响葡萄酒的口感和色泽，因此对酿酒葡萄与葡萄酒中单宁结构的分析特别是单宁聚合度的研究十分重要，今后应加强以下方面的研究：酿酒葡萄生长及葡萄酒酿造过程中单宁各组分之间变化规律和聚合度的研究；在结构分析的基础上结合单宁与唾液蛋白间的反应，区分定义优质单宁与劣质单宁；改善葡萄酒酿造工艺对葡萄酒中单宁各组分及其聚合度的研究。

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Research advances on tannins in grape berries and wine

LI Rui-rui1,2, ZHAO Xin-jie2, SUN Yu-xia1*

1(Institute of Agro-food Science and Technology, SAAS, Jinan 250100，China) 2(Shandong Key Lab of Microbial Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353, China)

ABSTRACTTannins is one of the most important phenolic compounds in grape berries and wine. It has an important influence on the character of the grape and wine. The concepts and classifications of tannins, the location of tannins in grape and evolution of tannins during ripening of grape, the form of tannin in the wine and the extracting tannins during winemaking, the research progress of analysis and detection methods were introduced in this paper. The research direction in future was also put forward.

Key wordstannins; grape berries; wine; analysis

收稿日期：2015-09-23，改回日期：2015-11-10

基金项目：山东省农业重大应用技术创新课；山东省现代农业产业技术体系创新团队项目基金(SDAIT-03-021-12)；云南省建立农科教相结合新型社会化服务项目(2014NG005)

第一作者：在读硕士研究生(孙玉霞高级工程师为通讯作者,E-mail:sunyuxia1230@163.com)。