任勃儒，谢飞，王庭欣，*（.河北大学质量技术监督学院，河北保定07000；2.邢台市桥西区食品药品监督管理局，河北邢台054000）



免疫层析技术在食品违禁成分检测中的应用

任勃儒1，2，谢飞1，王庭欣1，*
（1.河北大学质量技术监督学院，河北保定071000；2.邢台市桥西区食品药品监督管理局，河北邢台054000）

摘要：胶体金技术是一种新型的免疫标记技术，在食品安全检测领域得到广泛应用和快速发展。简述胶体金免疫层析技术在瘦肉精、蛋白精、非食用色素、抗生素等食品违禁成分领域的研究和应用，并对该技术的发展前景作了展望。

关键词：胶体金；免疫层析技术；食品违禁成分

食品中的违禁成分也称非食品添加成分，是指国家明令禁止在食品生产中添加的物质。2008年至今我国卫生部先后公布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》共6批。其中包括非食用物质比如苏丹红、三聚氰胺、氯霉素等48种（64个），易滥用的食品添加剂比如漂白剂（硫磺）、膨松剂（硫酸铝钾、硫酸铝铵）等22种。相继出台了部分违禁成分的国家标准检测方法。但大多数非食品添加成分的检测方法的研究正在进行中。

大量的文献报道显示，目前食品中违禁成分的检测方法都集中在高效液相色谱法[1]、气相色谱法[2]、液相色谱-质谱联用法[3]、酶联免疫吸附分析法（ELISA）[4]等。这些方法适用范围广，准确程度高，但检测时间长，检测步骤繁琐或成本较高，样品检测纯度要求高，不能满足现场快速检测的需要。胶体金免疫层析技术由于具有反应时间短、灵敏度高、特异性强、结果直观、成本低、不需要特殊的仪器设备、应用范围广、可适用多种检测条件等特点，已开始应用于食品中违禁成分的检测领域。

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。它是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，借助毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体（如抗体或抗原）发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过酶促显色反应或直接使用可目测着色标记物短时间（5 min～10 min）便可得到直观的试验结果。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

1　胶体金免疫层析技术在瘦肉精检测中的应用

“瘦肉精”是一类违禁药物的总称，主要有盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。传统的瘦肉精是克伦特罗，张慧嫦等采用免疫竞争法，将抗盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，并将人工合成的盐酸克伦特罗抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线，其与待测样品中的盐酸克伦特罗竞争结合胶体金标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体，并以颜色直观显示检测结果。试验结果表明检测猪肉等组织试样时，灵敏度最低值可达到0.5 ng/mL，只需3 min～5 min，与沙丁胺醇、莱克多巴胺的交叉反应率为0.86 %[5]。2003年国家出台了动物性食品中克伦特罗残留量的测定方法GB/T 5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》。肉品中盐酸克伦特罗的添加得到了有关部门的大力监管，由此盐酸克伦特罗的新型替代品相继出现。

莱克多巴胺正被作为一种新型瘦肉精被一些养猪场使用。由于莱克多巴胺在猪等动物体内具有残留并可通过生物链方式进入人体，当累积超过一定量时便表现出毒副反应，出现心率失常、肌肉疼痛等症状。赵彦岭等采用胶体金试纸卡法和LC-MS/MS法分别对猪肉、猪肝样品进行检测，结果表明两种方法的检测结果一致，胶体金试纸卡法特异性较高，样品前处理简单，检测快速，成本低[6]。同样沙丁胺醇也可改善脂肪型动物的肉和脂肪的比例，被用作盐酸克伦特罗的替代品。沙丁胺醇会残留在动物体内，人食用含沙丁胺醇较高的动物组织后会出现肌肉颤动、肌痛、头痛，甚至恶心、呕吐等中毒症状。吴巧丽等采用胶体金免疫竞争法将兔抗沙丁胺醇多克隆抗体-胶体金标记物包被在胶体金聚酯结合垫上，并将沙丁胺醇-BSA抗原包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，与待检测样中的沙丁胺醇竞争结合胶体金标记的兔抗沙丁胺醇多克隆抗体，可检测出猪肉等组织和饲料试样中沙丁胺醇的低限浓度为2 ng/mL，与盐酸克伦特罗的交叉反应率为2.67 %，且试验在3 min内完成，肉眼可判断结果[7]。

2　胶体金免疫层析技术在蛋白精检测中的应用

“蛋白精”是以三聚氰胺废料、羟甲基羧基氮等为原料制成的一类假蛋白饲料。主要成分为含氮杂环化合物，属于非蛋白质含氮化合物。三聚氰胺由于其含氮量较高，有时被非法添加到牛奶产品和动物饲料，它的毒性轻微，但若长期摄入，尤其是婴幼儿，会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。李洁等为了研究和验证免疫胶体金法快速检测乳制品中的三聚氰胺的效果，通过协同试验的方法，研究该方法的灵敏度、重复性、基质影响、特异性。利用随机于市场抽样乳品120件，分别用免疫胶体金法和国标法进行检测，验证该方法的假阴性、假阳性率。结果表明，用免疫胶体金法测定乳品中的三聚氰胺，检测限为0.5 mg/kg，方法的稳定性较好。样品中的亚硝酸盐、三聚氰酸、L-脯氨酸对测定结果无干扰，但尿素对测定结果有干扰。免疫胶体金法测定乳品中三聚氰胺的假阴性为0 %，假阳性率为0 %。可见，免疫胶体金法快速检测乳品中三聚氰胺，方法简便、快速、准确、稳定，可作为乳品中三聚氰胺现场快速检测的一种有效手段[8]。

3　胶体金免疫层析技术在非食用色素检测中的应用

天然食品在加工保存过程中容易褪色或变色，为了改善食品的色泽，人们常常在加工食品的过程中添加食用色素以改善感官性质，但是有些不法商贩只为牟取暴利向食品中添加一些非食用色素。国家卫生部发布的食品中可能违法添加非食用色素有7种，分别是苏丹红、碱性橙II、酸性橙II、碱性嫩黄、玫瑰红B、美术绿和孔雀石绿。

苏丹染料属于人工合成偶氮类染料，其中苏丹红I由于低廉的价格和好的着色效果，常被添加于一些食品中来提高食品（如含辣椒、咖喱、棕榈油的食品，冷冻肉，混合香辛料）的着色效果，吸引消费者。然而，苏丹红I在代谢过程中降解产生的中等毒性致癌物苯胺可以引起中毒性肝病，长期摄入苯胺也可造成人体神经系统损害。付云洁等通过设计合成苏丹红I衍生物，将其与明胶用混合酸酐法合成苏丹红-明胶免疫抗原，免疫新西兰白兔制备抗苏丹红I多克隆抗体，采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒大小为24.5 nm的胶体金，并制备苏丹红I-BSA抗原-胶体金复合物，组装检测试纸。试验结果表明，试纸条法的苏丹红I检测线为15 μg/kg，抗苏丹红I抗体与苏丹红II、III、IV均无交叉反应性，与高效液相测定差异不显著。检测时间5 min，适用于食品中苏丹红I残留的快速检测[9]。

碱性橙II是一种偶氮类碱性工业染料，由于碱性橙II比其他水溶性染料如柠檬黄、日落黄等相比更易于在豆制品中染色，因此一些不法商贩常用碱性橙II对豆腐皮和黄鱼进行染色，严重危害消费者的身体健康。贡东军等建立碱性橙II的酶联免疫分析方法。采用戊二醛偶联法将半抗原碱性橙II与载体牛血清白蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）制备免疫抗原碱性橙II-BSA和包被抗原碱性橙II-OVA。经紫外可见吸收光谱鉴定和大白兔免疫实验证实人工抗原成功合成，并制备抗碱性橙II的多克隆抗体。经动物实验证明了人工抗原的免疫原性，其抗血清抗体效价为1∶12 000，测定的最低检测限为0.01 ng/mL，该检测方法具有高灵敏度和特异性，可应用于食品中碱性橙II检测试剂盒的研制[10]。

孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀真菌、杀寄生虫的药物，长期超量使用可致癌，无公害水产养殖领域国家明令禁止添加。王权等采用无色孔雀石绿（LMG）单克隆抗体建立了水产品中孔雀石绿残留的间接竞争ELISA检测方法。结果表明LMG-McAb最佳稀释倍数为1∶80 000，包被抗原最佳质量浓度为0.80 μg/mL；竞争反应时的LMG理想稀释液为40 %乙腈水溶液；标准曲线呈线性相关，相关系数R2=0.982 3，最适检测范围1 ng/mL～256 ng/mL，最低检测限为1.29 ng/mL，批内和批间变异系数分别为4.307 %和4.566 %，鳗鱼肉样的平均添加回收率为90 %～110 %；该检测方法与隐性结晶紫、孔雀石绿、结晶紫的交叉反应分别为40.67 %、13.50 %和5.89 %，与其他抗生素无交叉反应[11]。

4　胶体金免疫层析技术在抗生素检测中的应用

氯霉素是一种广谱抗生素，具有良好的抗菌药理特性，被非法用于各类家禽、家畜、水生动物（鱼、虾等）及蜜蜂中各种传染病的防治。它在动物肉、奶、蛋等食品中的残留严重威胁人体健康，能引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病。王玉金等将抗氯霉素单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，并将人工合成的氯霉素抗原包被在硝酸-醋酸纤维素薄膜表面作为检测线，其与待测样品中氯霉素竞争结合胶体金标记的氯霉素单克隆抗体，并能以颜色直观显示检测的结果。用GICA与ELISA试剂盒对比检测了60份牛奶标本，两法符合率为100 %。GICA检测样品中氯霉素残留含量异性强，灵敏度高，简便快速，无需特殊仪器设备[12]。

四环素类药物为广谱抑菌剂，高浓度时具有杀菌作用，但四环素类药的滥用还引起该类药物在动物的肌肉、奶、肝脏等中残留，严重危害人类的健康。檀尊社等采用免疫竞争法，将抗四环素单克隆抗体一胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，制成胶体金试纸条。检测水产品试样时，试剂灵敏度最低值可达100 ng/mL，仅需5 min～10 min，与金霉素、土霉素、强力霉素等四环素族抗生素有很强的交叉反应，故可同时检测四环素族中几种主要抗生素，而与沙丁胺醇、莱克多巴胺等其他兽药无交叉反应。试验证明检测试剂具有较高的灵敏度及特异性，操作便捷，稳定可靠，可作为四环素残留现场监控的有效筛检手段[13]。

庆大霉素由于其抗菌谱广、疗效佳，且价格低廉而被广泛用于畜禽饲料中。食品中的过量残留会对食品安全造成严重威胁，主要表现为损害人体器官前庭和耳蜗神经，导致眩晕和听力减退，还可能引起耳毒性和肾毒性。杨俊等采用免疫竞争法柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒，标记抗庆大霉素单克隆抗体并喷与玻璃纤维上，庆大霉素偶联抗原和羊抗兔二抗分别包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线和控制线。庆大霉素快速检测试纸条的灵敏度为0.7 μg/mL，检测时间为10 min，与其他同类物质无交叉反应，其检测结果与酶联免疫吸附测定法检测结果呈现了很好的一致性。该方法快速简便。灵敏度高、特异性强、准确性和稳定性好，非常适合现场快速检测庆大霉素[14]。

链毒素是一种氨基糖甙类抗生素，对鸡、羊、牛、猪的各类炎症有很好的疗效，因此经常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂使用，近年来也常用于防治蜜蜂幼虫病，但它容易损害听觉神经，严重时会导致耳聋，对肾脏也有毒性，毒副作用较严重。倪同浩等采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，胶体金标记抗体经纯化后吸附在玻璃纤维膜上，将检测线和羊抗鼠质控线分别包被在硝酸纤维素膜上，分别经过处理干燥后与样品垫、吸水纸组装成试纸条。使用试纸条对SM标准液检测，检测限为100 ng/mL，该试纸条对新霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、恩诺沙星、氨苄青霉素、磺胺喹噁啉无交叉反应[15]。

5　结语

免疫胶体金技术具有简便快速，特异性强、敏感性高，肉眼判断，试验结果易保存，无需特殊仪器设备和试剂等优点，这些特点是其他检测方法和免疫学方法所无法比拟的。由于其自身的优势，使得免疫胶体金技术成为继荧光素、放射性同位素和酶标记技术后发展起来的第四大标记技术，非常适合于广大基层检验人员以及大批量检测和大面积初筛等，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。随着该技术应用范围的扩展和研究的深入，提高胶体金的制备质量，进一步提高检测灵敏度、拓展检测范围，实现半定量或定量检测实现多元化检测是胶体金技术未来的发展方向。

参考文献：

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[15]倪同浩.链霉素胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制[D].扬州:扬州大学,2009:1-47

Colloidal Gold Immune Chromatography Technology in the Application of Food Banned Substances

REN Bo-ru1，2，XIE fei1，WANG Ting-xin1，*
（1. College of Quality and Technical Supervision，Hebei University，Baoding 071000，Hebei，China；2. Xingtai Qiaoxi Food and Drug Administration，Xingtai 054000，Hebei，China）

Abstract：Colloidal gold technique is a new kind of immune markers.It has widely used for the field of food safety testing and rapid development.This paper briefly described the colloidal gold immune chromatography technology in lean meat powder，protein powder，edible pigment，antibiotics and other banned substances in the field of research and application of food，and pointed out its application prospect.

Key words：colloidal gold；immune chromatography technology；food banned substances

收稿日期：2015-02-10

*通信作者：王庭欣（1965—），女（汉），教授，硕士研究生导师，研究方向：食品安全质量控制。

作者简介：任勃儒（1992—），女（汉），在职硕士研究生，研究方向：食品检验与标准化。

基金项目：河北省自然科学基金资助项目（C2013201278）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.046