吴树才，杨永辉，李辉，郭素敏，李秀武，杜杰杰，宋利超，高莉(河北省胸科医院，石家庄05004；河北师范大学生命科学学院)



人胎盘间充质干细胞对小鼠肺纤维化的影响及机制

吴树才1，杨永辉1，李辉1，郭素敏1，李秀武2，杜杰杰2，宋利超2，高莉2(1河北省胸科医院，石家庄050041；2河北师范大学生命科学学院)

摘要：目的观察人胎盘间充质干细胞对小鼠肺纤维化的影响，并探讨其作用机制。方法采用组织块贴壁法分离并体外培养人胎盘间充质干细胞。将30只C57BL/6小鼠随机均分为观察组、对照组，均给予气管内注入博来霉素8.5 mg/kg建立肺纤维化模型。造模成功后，观察组尾静脉输注体外培养的人胎盘间充质干细胞0.3 mL(细胞数为1.0×106个)，对照组注射等量生理盐水，1次/d，连续注射3天；处死小鼠，取肺组织，检测肺组织羟脯氨酸含量，采用Western blotting法检测肺组织血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素1(ET-1)和血管生成素2(Ang-2)蛋白。结果观察组肺组织羟脯氨酸含量为(5.76±0.13)μg/mL，对照组为(8.13±0.87)μg/mL，两组比较P<0.01。观察组肺组织VEGF的相对表达量为52.7±4.7、ET-1为68.1±5.4、Ang-2为59.6±2.8，均较对照组(100)降低(P均<0.05)。结论人胎盘间充质干细胞可抑制小鼠肺组织纤维化形成；降低肺组织VEGF、ET-1和Ang-2表达可能是其作用机制。

关键词：肺纤维化；胎盘间充质干细胞；博来霉素；血管内皮生长因子；内皮素1；血管生成素2；小鼠

肺纤维化是各种内外致病原引起慢性肺疾病的共同结局，是涉及细胞、细胞因子、细胞外基质(ECM)等多因素、多环节的复杂疾病[1]，但其发生的确切机制仍不明确。激素和非激素免疫抑制剂、抗纤维化、抗细胞因子及免疫调节等是目前临床常用治疗肺纤维化的方法，但效果均不佳，患者病死率高[2，3]。研究发现，干细胞移植可以抑制病变器官修复过程中的组织重塑与纤维化过程[4]。胎盘间充质干细胞是从胎盘获取的一类干细胞，是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的新型干细胞，具有不被受体免疫系统拒绝的优点[5]。2014年3月～2015年11月，我们观察了人胎盘间充质干细胞对小鼠肺纤维化的影响，并探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料C57BL/6小鼠30只，雌性，6～8周龄，平均体质量19.8 g，购自中国科学院上海实验动物中心，饲养于河北师范大学实验动物中心SPF级动物房。博莱霉素粉针剂购于哈尔滨莱博通药业有限公司，生理盐水稀释，配制成终浓度为1.7 mg/mL的博来霉素溶液。CD73、CD90、CD105、HLA-DR、CD19、CD34、CD45、鼠抗人IgG2a和IgG1抗体均购自BioSciences公司，血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素1(ET-1)和血管生成素2(Ang-2)抗体购自美国Santa Cruz CA公司。

1.2人胎盘间充质干细胞分离、培养和鉴定剪取健康新生儿废弃胎盘的胎盘绒毛膜面组织(厚1～2 cm)，剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎块，PBS漂洗至无色，转入细胞培养瓶中，加入3 mL间充质干细胞培养液，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。选取处于对数生长期的第三代胎盘间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞悬液于离心管中，制备成细胞密度为1×105/mL的细胞悬液；取9只试管，分别加入150 μL细胞悬液，再分别加入鼠抗人单克隆抗体CD73、CD90、CD105、HLA-DR、CD19、CD34、CD45，以鼠抗人IgG2a-FITC、IgG1-PE作为阴性对照，室温避光放置10 min。流式细胞仪检测结果显示，培养的人胎盘间充质干细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105，不表达HLA-DR、CD19、CD34、CD45，证明其具有间充质干细胞特性，细胞培养成功。

1.3动物分组及处理将小鼠随机分为观察组及对照组各15只。两组均制备肺纤维化模型[5,6]：经腹腔注射速眠新针麻醉，暴露气管，气管内注入博来霉素溶液(8.5 mg/kg)0.1 mL，旋转小鼠变换体位，使博莱霉素均匀分布。造模第4天，对照组经尾静脉注射生理盐水0.3 mL，观察组经尾静脉注射体外培养的人胎盘间充质干细胞0.3 mL(细胞数为1.0×106个)，均每天注射1次，连续注射3天。X-半乳糖(X-gal)染色结果显示，干细胞经静脉注射进入体内后能够在肺脏中定植。处死小鼠，取肺组织。

1.4相关指标观察

1.4.1肺组织羟脯氨酸含量将左肺组织烘干，研碎成为组织粉末。两组均称取7.5 mg肺组织粉末置于水解管中，加入3 mL 6 mol/L盐酸震荡悬浮，110 ℃酸解18 h。取1 mL酸解液中和、还原、沸水浴及萃取后，DMBA显色，采用标准曲线法计算羟脯氨酸含量。

1.4.2肺组织VEGF、ET-1、Ang-2蛋白相对表达量采用Western blotting法。提取右肺组织总蛋白，进行聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，将特异性条带电转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭，分别与VEGF(1∶500)、ET-1(1∶500)、Ang-2(1∶300)特异性抗体孵育，辣根过氧化物酶标记抗体，摄片。将同一张蛋白印迹膜曝光后，采用洗脱抗体再进行孵育杂交。以GAPDH作为内参照。将对照组的表达量计为100，计算观察组相对表达量。每项实验重复检测3批次以上的不同样本，取平均值。

2结果

2.1两组肺组织羟脯氨酸含量比较观察组肺组织羟脯氨酸含量为(5.76±0.13)μg/mL，对照组为(8.13±0.87)μg/mL，两组比较P<0.01。

2.2两组肺组织VEGF、ET-1和Ang-2蛋白相对表达量比较观察组肺组织VEGF的相对表达量为52.7±4.7、ET-1为68.1±5.4、Ang-2为59.6±2.8，均较对照组(100)降低(P均<0. 05)。

3讨论

间充质干细胞具有多向分化、支持造血、促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作相对简单等特点。间充质干细胞作为种子细胞，在临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病，在修复器官功能方面具有无可比拟的优势[7,8]； 作为免疫调节细胞， 治疗免疫排斥和自身免疫性疾病[9]。胎盘间充质干细胞是从胎盘获取的一类干细胞，与从脐带血或骨髓中提取的干细胞相比，其提取干细胞数量更多、可分化的组织细胞更广泛[10]，且不存在免疫排斥反应。胎盘来源干细胞取自母体生产后的胎盘组织，其提取过程对母体和新生儿不会造成任何损伤，来源不受伦理学和临床医学的限制，是最理想的干细胞保存和利用资源。胎盘来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。Lazarus等[11]提取并培养缓解期血液肿瘤患者的自体胎盘间充质干细胞，在体外扩增培养4～7周后静脉注射入患者体内，注射后未观察到机体出现不良反应。目前自体胎盘间充质干细胞的临床应用逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病、心脏系统疾病等，均证实经静脉输注胎盘间充质干细胞安全可靠。Ninichuk等[12]将原始的成血管细胞注射进入肝脏纤维化模型大鼠的病变肝脏中，发现肝脏纤维化程度减轻。给予慢性肾损伤模型小鼠每周注射多能间充质干细胞(6～10周)，可减少肾脏的间质容量、间质胶原含量及表达平滑肌肌动蛋白的间质细胞数量，从而减轻肾脏纤维化。上述研究结果提示，干细胞移植可抑制病变器官修复过程中的组织重塑与纤维化过程，有利于器官功能的修复。

肺纤维化的病理特征为肺泡壁(肺泡炎)受损，成纤维细胞/肌成纤维细胞异常聚集，胶原蛋白和其他ECM过度沉积，异常组织修复导致肺功能丧失[13,14]。羟脯氨酸是胶原蛋白的主要组分，其水平反映胶原蛋白含量。本研究给予肺纤维化小鼠连续3天静脉注射人胎盘间充质干细胞，结果显示观察组肺组织羟脯氨酸含量降低，提示人胎盘间充质干细胞可抑制肺纤维化小鼠肺组织纤维化形成。研究发现，VEGF、ET-1和Ang-2可促进内皮细胞迁移、增殖及血管生成；Ang-2还能抑制脉络膜新生血管的生成和成熟，促进瘢痕形成，引起肺结构重塑，刺激肺成纤维细胞增殖，并调节成纤维细胞的趋化、增殖，合成胶原，导致胶原和纤维素沉积增多，造成肺泡壁基底膜增厚和弥漫性上皮下纤维化[15～17]。本研究结果显示，观察组肺组织VEGF、ET-1和Ang-2蛋白表达明显降低，提示人胎盘间充质干细胞可通过降低以上三种蛋白的表达进而抑制微血管形成、延缓肺组织纤维化进程。

总之，胎盘间充质干细胞可抑制肺组织纤维化形成；降低肺组织VEGF、ET-1和Ang-2蛋白表达可能是其作用机制。

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Effect of placenta-derived mesenchymal stem cells on pulmonary fibrosis in mice and its mechanism

WUShucai1,YANGYonghui,LIHui,GUOSumin,LIXiuwu,DUJiejie,SONGLichao,GAOLi

(1HebeiProvinceChestHospital,Shijiazhuang050041,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of placenta-derived mesenchymal stem cells on the pulmonary fibrosis in mice and to explore its mechanism. MethodsHuman placenta-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro by tissue explants adherent method. Thirty C57BL/6 mice were randomly divided into the observation group and the control group, and all mice were injected with 8.5 mg/kg to establish the model of pulmonary fibrosis. After the models were successful established, mice in the observation group received intravenous injection of placenta-derived mesenchymal stem cells 0.3 mL (cell number of 1.0×106), and mice in the control group were injected with the same amount of normal saline, once a day for 3 days. Then, the mice were killed to collect the lung tissues to determine the content of hydroxyproline. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), endothelin 1 (ET-1) and angiogenin 2 (Ang-2) proteins was determined by Western blotting. ResultsThe hydroxyproline contents in the lung tissue of observation group and control group were respectively (5.76±0.13) μ/mL and (8.13±0.87) μg/mL, and significant difference was found between the two groups (P<0.01). The expression of VEGF, ET-1 and Ang-2 in the lung tissues of the observation group was respectively 52.7±4.7, 68.1±5.4 and 59.6±2.8, which was all lower than that of the control group (all P<0.05). ConclusionPlacenta-derived mesenchymal stem cells can inhibit the formation of pulmonary fibrosis and its mechanism may be related with the decreased expression of VEGF, ET-1 and Ang-2 protein in lung tissue.

Key words:pulmonary fibrosis; placenta-derived mesenchymal stem cells; bleomycin; vascular endothelial growth factor; endothelin 1; angiogenin 2; mice

(收稿日期：2015-12-02)

中图分类号：R563

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)12-0013-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.004

通信作者简介：杨永辉(1972-)，男，主任医师，主要研究方向为病理学诊断及细胞免疫治疗。E-mail： yonghuiyang@vip.163.com

第一作者简介：吴树才(1963-)，男，主任医师，主要研究方向为结核及呼吸系统疾病。E-mail： shucaiwu2009@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31101638)；河北省省级重大医学科研课题(ZD2013060)。