陈利娇，喻文彬，任曼曼，岑胜丹，邓辉，胡荣党

（温州医科大学附属口腔医院，浙江 温州 325027，1.正畸科；2.牙周科）



黄芩素对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响

陈利娇1，喻文彬1，任曼曼2，岑胜丹2，邓辉2，胡荣党1

（温州医科大学附属口腔医院，浙江 温州 325027，1.正畸科；2.牙周科）

[摘 要]目的：探讨中药黄芩提取物黄芩素对人牙周膜细胞（hPDLCs）增殖和成骨分化功能的影响。方法：原代培养hPDLCs，向hPDLCs中分别加入浓度为0.3125、0.625、1.25 μmol/L的黄芩素作为实验组，对照组不加黄芩素。MTT法检测黄芩素对hPDLCs增殖的影响后，分别采用碱性磷酸酶（ALP）活性测定、茜素红S染色、Real-time PCR和Western Blot法研究黄芩素对hPDLCs ALP活性、矿化结节形成、I型胶原（Col-I）mRNA和蛋白表达的影响。结果：与对照组相比，各浓度黄芩素对hPDLCs增殖均无明显影响；各浓度黄芩素组均表现为ALP活性上升；同时骨向诱导21 d后可见黄芩素组矿化结节形成增加，定量分析结果显示1.25 μmol/L黄芩素组形成矿化结节数量最多；Real-time PCR和Western Blot结果显示各浓度黄芩素组Col-I mRNA和蛋白表达均有上升，7 d时随浓度的增加其表达上升，1.25 μmol/L黄芩素组达到最高水平。结论：黄芩素能促进hPDLCs的骨向分化能力，具有进一步研究其辅助牙周再生治疗的价值。

[关键词]牙周炎；黄芩素；人牙周膜细胞；骨向分化

慢性牙周炎是累及牙周支持组织的慢性感染性疾病，可造成牙槽骨吸收、附着丧失和牙周袋形成，最终导致牙齿松动，是成年人牙齿脱落的主要原因之一[1]。目前，牙周炎治疗主要包括基础治疗和手术治疗，治疗的最终目标是控制炎症，并实现牙周组织特别是牙槽骨的再生和新附着的形成。人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）作为牙周膜中的主要功能细胞，能向成骨细胞、成牙骨质细胞分化，形成矿化组织，在牙周软硬组织的修复再生中发挥着重要作用，如何促进hPDLCs骨向分化是实现牙周炎患者牙周组织再生的关键之一[2]。随着生物制药技术的发展和祖国医学的推广，应用中药来控制牙周炎症，阻断牙槽骨吸收和促进牙槽骨再生被认为可能成为牙周治疗的辅助手段之一[3]。如有研究表明，中药骨碎补的提取物能促进小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的增殖、分化[4-5]。

黄芩是唇形科植物黄芩的干燥根，是我国著名的传统中药，研究表明其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、解热镇痛、抗变态反应、抗糖尿病等广泛的药理学活性[6-11]。黄芩素（5，6，7-三羟基黄酮，baicalein）是从黄芩的干燥根中提取的一种黄酮类化合物，是黄芩的主要有效单体之一[12]。有文献报道黄芩素能促进小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化[13]。然而，有关黄芩素能否促进牙槽骨新生，从而在牙周组织再生中发挥作用，国内外尚未见报道。为此，本研究从细胞和分子水平探讨不同浓度、不同时间的黄芩素作用对hPDLCs增殖和成骨分化功能的影响，为今后黄芩素应用于牙周组织再生提供实验依据。

1　材料和方法

1.1试剂与仪器

1.1.1主要试剂：DMEM培养基、胰酶、胶原酶（Gibco，美国），胎牛血清（fetal calf serum，FBS，Millipore，美国），黄芩素（纯度≥98%）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸、茜素红S、MTT（Sigma，美国），SYBR Green I染料（Roche，瑞士），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性检测试剂盒（南京建成），山羊抗人I型胶原（collagenase-I，Col-I）蛋白多抗、β-actin单抗、兔抗山羊二抗（CST，美国），BCA试剂盒（杭州弗德），反转录试剂盒（Takara，日本），引物、Trizol试剂（Invitrogen，美国），其余试剂均为国产分析纯或进口分装。

1.1.2主要仪器：超净台（苏州净化），倒置显微镜（Nikon，日本），PCR扩增仪、化学发光仪、电泳仪、转膜仪（Bio-Rad，美国），酶标仪（TECAN，瑞士），LightCycle 480荧光定量PCR仪（Roche，瑞士），培养瓶、培养板（Corning，美国）。

1.2实验方法

1.2.1hPDLCs的培养与鉴定：选取温州医科大学附属口腔医院口腔外科门诊拔除的第三磨牙。要求患者年龄为20～30岁，牙体无龋损，牙周组织无炎症。用无菌PBS液反复冲洗，无菌条件下刮取牙根中1/3的牙周膜组织，剪碎，用0.3% I型胶原酶37 ℃消化30 min，离心（1 500×g）5 min，弃上清，置于T25培养瓶中，加入含有10% FBS、0.1 μg/L青霉素、0.1 μg/L链霉素的DMEM培养液1 mL，37 ℃，5% CO2饱和条件下培养12 h后，补加培养液2 mL后继续培养。每隔3 d换液，待细胞长满至80%后，0.25%胰酶消化，传代。采用抗波形蛋白与抗角蛋白染色鉴定细胞来源，选取3～5代细胞进行后续试验。本研究经温州医科大学附属口腔医院医学伦理委员会批准，事先告知患者并签署知情同意书。

1.2.2实验分组：DMSO溶解黄芩素制成100 mmol/L储存液备用。以含10% FBS的培养液梯度稀释成含0.3125、0.625和1.25 μmol/L浓度黄芩素的培养液。选取3～5代的hPDLCs以5×104个/mL密度接种到6孔板中，待细胞融合率达到70%后，吸弃原培养液，加入不同浓度的黄芩素，设0.3125、0.625和1.25 μmol/L组3个实验组，加入0.1% DMSO作为对照组（下文图内均标为control），分别培养3、7、11 d后，测定Col-I mRNA和蛋白的表达水平。各组培养7 d后换成骨诱导液（含5 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/mL抗坏血酸、10-5mmol/L地塞米松、10% FBS的DMEM培养液），每隔3 d换液，连续诱导21 d，行茜素红S染色。

1.2.3MTT法测定黄芩素对hPDLCs增殖的影响：以5 000个/孔的密度接种hPDLCs于96孔板，每孔加入100 μL的培养液，培养24 h后，吸弃原有培养液，加入不同浓度的黄芩素分别培养1、3、5和7 d后，吸弃培养液，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37 ℃，5% CO2条件下避光孵育4 h，每孔加入DMSO 150 μL，摇床振荡10 min后，酶标仪测OD490值。含10% FBS的培养液作为空白对照，设4个复孔。

1.2.4ALP活性测定：各组细胞培养3、7和11 d，根据ALP试剂盒说明书操作，酶标仪测定各孔的OD520值，再换算出各组的ALP活性。

1.2.5茜素红S染色、矿化结节定量：各组细胞诱导21 d后，弃培养液，PBS漂洗3次，经4%多聚甲醛4 ℃固定30 min，行茜素红S（1 mg/mL）染色。茜素红S染色拍照后，每孔加入等量的氯化十六烷基吡啶溶液溶解矿化结节，酶标仪测OD560值，比较各组形成矿化结节的数量。

1.2.6实时荧光定量PCR（Real-time PCR）：采用Trizol试剂提取各组细胞样本的RNA，通过OD280/OD260比值来测定其纯度，比值在1.8～2.0之间为合格。然后根据PrimeScriptTMRT-PCR Kit说明在20 μL反应体系中进行反转录反应合成cDNA。反应体系如下：1 μg Total RNA、4 μL 5‘PrimeScript Buffer、1 μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I、1 μL oligo（dT）primer和1 μL random 6 mers，RNase free dH2O补足20 μL。反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。合成好的cDNA置于-70 ℃保存备用。引物序列如表1所示，设计和合成由Invtrogen公司完成。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪进行检测，扩增反应体系如下：10 μL SYBR Green Premix Ex Taq（2×）、1 μL Forward和Reverse Primer、2 μL cDNA template、6 μL ddH2O。扩增步骤包括预变性：95 ℃ 30 s，1个循环；扩增：95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40个循环；融解：95 ℃5 s，65 ℃ 1 min，1个循环；冷却：40 ℃ 30 s，1个循环。每个cDNA样本设2个复孔，实时监测每个反应的循环荧光信号，获得Ct（cycle threshold）值。然后根据目的基因Col-1和管家基因β-actin的Ct值通过相对定量方法2-△△Ct进行统计分析。每个样本重复测试3次，取平均值。

表1　引物序列

1.2.7Western Blot：采用RIPA全细胞裂解液（含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂）置于冰上裂解各组细胞样本20 min，用刮刀将细胞刮起转移到EP管中。根据BCA试剂盒使用说明对蛋白进行定量。将煮沸后的蛋白通过8% SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上，5%的脱脂牛奶封闭2 h，一抗Col-I （1:1 000）和β-actin（1:1 000）4 ℃孵育过夜，接着采用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的兔抗山羊二抗室温摇床孵育2 h，免疫反应条带用ECL增强化学发光显带，按照试剂说明书在暗室条件下进行拍照。

1.3统计学处理方法 所有统计分析由SPSS19.0软件完成。数据以±s表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1hPDLCs原代培养及鉴定 倒置显微镜下观察可见原代培养1周后有细胞从组织块中爬出，2周后细胞密集呈放射状生长（见图1A）。传代1 d后大多数细胞为长梭形或多角形（见图1B）。免疫组织化学染色后观察可见波形蛋白染色呈阳性（见图1C），角蛋白染色呈阴性（见图1D），证实培养的细胞来源于中胚层间充质而不是上皮。根据细胞形态并结合取材部位可以确定是hPDLCs。

A：原代培养2周；B：传代培养1 d；C：波形蛋白染色阳性；D:角蛋白染色阴性图1　hPDLCs的培养及鉴定(×100)

2.2黄芩素对hPDLCs增殖的影响 黄芩素刺激1、3、5和7 d后，0.3125 μmol/L组、0.625 μmol/L 组OD值略大于对照组，1.25 μmol/L组略小于对照组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。各浓度黄芩素对hPDLCs的增殖无明显影响，见图2。

2.3黄芩素对hPDLCs ALP活性的影响 与对照组相比，1.25 μmol/L黄芩素作用3 d，其ALP活性上升（P＜0.05）；7 d时，各实验组ALP活性继续上升，1.25 μmol/L组最高（P＜0.01）；作用11 d后，各实验组ALP活性较7 d时有所下降（P＜0.05），但仍较对照组高（P＜0.05），见图3。

2.4矿化结节形成及定量分析 各组细胞体外成骨诱导21 d后，镜下可见细胞呈现复层生长，聚集形成圆形结节。茜素红S染色后肉眼可见：随着黄芩素浓度的增加，染色逐渐加深（见图4A）；镜下可见红色矿化结节，结节中心染色深，呈黑红色，向外周逐渐变淡，其四周呈白色云雾状（见图4B）。染色结果显示，与对照组相比，随着黄芩素浓度的增加，矿化结节形成数量逐渐增多。OD值定量分析结果表明加入黄芩素后，形成矿化结节数量增多（P＜0.01），1.25 μmol/L组最多，呈浓度依赖性（见图4C）。

图2　黄芩素对hPDLCs增殖的影响

与对照组比：aP＜0.05，bP＜0.01图3　黄芩素对ALP活性的影响

2.5黄芩素对hPDLCs Col-I mRNA和蛋白表达的影响 Real-time PCR结果发现，黄芩素作用3 d，0.3125 μmol/L组Col-I的mRNA表达量高于对照组（P＜0.01），0.625 μmol/L组略上升，1.25 μmol/L组则低于对照组（P＜0.05）；7 d后，Col-I mRNA的表达随着浓度增加而上升，差异具有统计学意义，1.25 μmol/L时最高（P＜0.01）；随着作用时间延长到11 d，其表达水平较7 d时略下降（见图5A）。Western Blot结果表明，与对照组相比，Col-I蛋白表达水平在0.3125 μmol/L黄芩素作用3 d时有所上升（P＜0.05）；7 d时随着黄芩素浓度的增大Col-I蛋白表达量随之上升（P＜0.05），1.25 μmol/L组表达水平达到最高（P＜0.001）；黄芩素作用11 d后其表达较7 d时有所下降，但0.3125、0.625 μmol/L组仍较对照组高（P＜0.05）（见图5B、C）。

A：成骨诱导21 d茜素红S染色后肉眼观；B：成骨诱导21 d茜素红S染色后镜下观（×100）；C：矿化结节定量分析（bP＜0.01）图4　黄芩素对hPDLCs矿化结节形成的影响

A：hPDLCs 3、7、11 d时Col-I mRNA表达水平；B：hPDLCs 3、7、11 d时Col-I蛋白表达水平；C：蛋白表达的相对定量分析（aP＜0.05，bP＜0.01）图5　黄芩素对 Col-I mRNA和蛋白表达水平的影响

3　讨论

牙周炎最主要的病理改变是牙槽骨吸收。传统的牙周治疗对于控制牙周炎及其进展有很好的效果，但是很难恢复已经破坏的牙周组织尤其是硬组织，其导致的咀嚼功能下降也较难得到彻底改善。近年来牙周组织工程的发展为实现牙周组织的再生带来了希望[14]。hPDLCs作为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞等的前体细胞，如何诱导其分化形成包括牙槽骨在内的牙周组织，已成为牙周组织工程的重要研究方向之一[15]。因此，如何促进hPDLCs骨向分化是牙周再生治疗的关键之一。近年来的研究主要集中于骨再生相关的细胞因子上。Lee 等[16]研究发现成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor 2，FGF-2）能促进牙周前体细胞的增殖和分化，并形成矿化组织，证实其在牙周硬组织再生中发挥重要作用。Acil等[17]也发现骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7）能诱导hPDLCs向成骨细胞、成牙骨质细胞分化。还发现釉基质蛋白（emdogain，EMD）能促进hPDLCs骨向分化，促进牙周组织再生[18-20]。另有学者研究发现一氧化氮在血红素氧合酶的作用下能促进hPDLCs向成骨细胞分化，推测其可能是牙周组织再生中的一个重要的媒介因子[21]。

随着生物技术的发展，中药的有效单体和成份被成功分离和鉴定，中药治疗日益受到关注，其药性缓和、不良反应较小且价格廉惠、药源丰富都将成为它的优势所在。黄芩作为唇形科多年生草本植物，是我国著名的传统中药材，临床应用有悠久的历史，它包含黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素和汉黄芩苷等黄酮类有效成分，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、解热镇痛、抗变态反应、抗糖尿病、降压、镇静等多种作用[7-11，22-23]。研究表明，黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素能够促进牙龈成纤维细胞胶原蛋白和总蛋白的合成，其中以黄芩素和黄芩苷的作用最强[24]。Liu等[25]发现黄芩素和汉黄芩素能促进hPDLCs的增殖和基质矿化。蔡霞等[26]研究证实黄芩苷能明显促进hPDLCs增殖及增加细胞总蛋白，并能减少大鼠实验性牙周炎牙周组织的破坏。黄芩素作为黄芩中提取的一种主要的有效单体，Kim等[13]研究发现其可促进小鼠MC3T3-E1细胞成骨向分化，加速骨的生成。此后，他们又发现黄芩素能抑制破骨细胞的分化，促进其凋亡，并通过抑制成熟破骨细胞的骨吸收作用抑制骨吸收[27]。

本实验通过酶消化结合组织块法培养出hPDLCs，并通过免疫组织化学染色波形蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性，证实其中胚层来源。当加入不同浓度的黄芩素时，MTT结果显示其对细胞增殖活力无明显影响，表明本实验所选3个浓度均未对hPDLCs造成毒性作用，这与以往发现相同浓度的黄芩素对小鼠MC3T3-E1细胞的活力无影响的结果[13]相一致。但Liu等[25]发现黄芩素能促进hPDLCs的增殖，这可能是因为其研究中所用黄芩素的浓度较本研究低所致。ALP在骨形成和矿化中发挥着重要的作用，是反映成骨活性的标志之一，组织中某些具有成骨分化特性的细胞开始分化时，ALP的活性可显著升高[28]。本研究发现，hPDLCs在不同浓度的黄芩素作用下，ALP活性均高于对照组，1.25 μmol/L组在作用7 d时上升最明显，11 d时有所下降，但仍高于对照组。这可能与ALP是骨基质矿化早期的重要酶有关，随着成骨分化晚期钙盐沉积逐渐增多，ALP活性逐渐减弱[28-29]。成骨诱导液中的地塞米松、抗坏血酸等成分可诱导细胞向成骨细胞转化，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节，其在茜素红S染液作用下呈红色。实验组在黄芩素作用7 d并成骨诱导3周后，茜素红S染色可见大量红色矿化结节形成，表明细胞外基质矿化，钙盐沉积。Col-I是骨组织基质的主要成分，与成骨细胞的分化、骨组织的修复与重建密切相关，可作为检测成骨分化早中期的标志物[30-31]。本实验检测了不同浓度黄芩素在不同作用时间对hPDLCs Col-I mRNA和蛋白表达的影响，证实在7 d时，Col-I的表达随着黄芩素浓度的增加而逐渐上升，黄芩素的浓度为1.25 μmol/L时，Col-I的表达最高。提示在本研究条件下，1.25 μmol/L黄芩素作用7 d促进hPDLCs成骨分化的效果最佳。本研究结果提示黄芩素有较强的促进hPDLCs骨向分化的作用。

综上所述，黄芩素对hPDLCs具有一定的成骨促进作用，有望未来用于牙周组织再生治疗当中。本研究为进一步探讨黄芩素应用于牙周组织的修复再生提供了前期的理论基础和实验依据。黄芩素促进成骨的具体机制及其效果还需今后更多的体内外研究来进一步阐明。

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(本文编辑：丁敏娇)

·论 著·

The effects of baicalein on promoting the osteogenesis of human periodontal ligament cells

CHEN Lijiao1,YU Wenbin1,REN Manman2,CEN Shengdan2,DENG Hui2,HU Rongdang1.1.Department of Orthodontics,Hospital of Stomatology,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027; 2.Department of Periodontics,Hospital of Stomatology,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Abstract:Objective:To evaluate the effects of baicalein extracted from Scutellaria baicalensis Georgi on the function of proliferation and osteogenesis of human periodontal ligament cells (hPDLCs).Methods:Baicalein at a concentration of 0.3125,0.625,1.25 μmol/L was added into hPDLCs primary cultured in vitro accordingly as experimental group,the one with no baicalein as blank control group.The effect of proliferation of hPDLCs was assessed through MTT assay.Alkaline phosphatase (ALP) activity assay,Alizarin red S staining,RT-qPCR and Western Blot were used to observe the ALP activity,formation of mineral nodules,mRNA and protein expression of collagenase-Ι (Col-Ι) of hPDLCs,respectively.Results:Compared to the control group,baicalein at different concentrations had no signifi cant infl uence on the proliferation of hPDLCs.Baicalein was shown to enhance the ALP activity of hPDLCs.After 21 days of osteogenic induction,more mineral nodules could be observed compared to the control group,which increased in a dose-dependent manner at the concentration of 0.3125-1.25 μmol/L baicalein according to the results of quantifi cation.The mRNA and protein level of Col-Ι increased by baicalein in different concentration,which reached maximum at 7 days,appearring in a dosedependent manner from 0.3125 to 1.25 μmol/L using Western Blot and Real-time PCR analysis.Conclusion:Baicalein can promote hPDLCs to differentiate into osteoblasts,which is of great value for further study acting as the adjuvant drug for periodontal regenerative therapy.

Key words:periodontitis; baicalein; human periodontal ligament cells; osteogenic differentiation

通信作者：胡荣党，教授，硕士生导师，Email：hurongdang@ hotmail.com。

作者简介：陈利娇（1991-），女，浙江永康人，硕士生。

基金项目：浙江省中医药科技计划项目（2015ZA122）；浙江省自然科学基金资助项目（LY12H14003）；国家自然科学基金资助项目（81200795）。

收稿日期：2015-08-09

[中图分类号]R78

[文献标志码]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.01.002