张煜炯， 彭 昕，*， 吉庆勇， 郭巧生（.浙江医药高等专科学校，浙江宁波500；.南京农业大学中药材研究所，江苏南京0095；.丽水市绿谷三叶青珍稀植物研究所，浙江丽水000）



聚类分析和主成分分析法研究三叶青氯仿部位HPLC指纹图谱

张煜炯1， 彭 昕1，2*， 吉庆勇3， 郭巧生2
（1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波315100；2.南京农业大学中药材研究所，江苏南京210095；3.丽水市绿谷三叶青珍稀植物研究所，浙江丽水323000）

摘要：目的 建立不同产地三叶青药材氯仿部位的HPLC指纹图谱，并进行聚类分析和主成分分析。方法 分析采用Agi1ent C18色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长210 nm。结果 17批三叶青样品的HPLC指纹图谱中有15个共有峰，其中3个峰被确认为槲皮素、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷和β-谷甾醇。结论 样品产地可被聚成5类，并且4个主成分的累计方差贡献率为85.38%。

关键词：三叶青；氯仿部位；HPLC指纹图谱；聚类分析；主成分分析

The ana1ysiswas performed on Agi1ent C18co1umn，mobi1e phase was acetonitri1e-0.1% phosphoric acid aqueous so1ution with gradient e1ution，f1ow ratewas1.0 mL/min，co1umn temperaturewasmaintained at30℃，and detection wave1ength was setat210 nm.RESULTS Therewere fifteen common peaks in the HPLC fingerprints of seventeen batches of Tetrastigma hemsleyanum samp1es，three ofwhich were identified as quercetin，kaempfero1-3-O-rutinoside and β-sitostero1.C0NCLUSI0N The growing areas of samp1es can be c1assified into five groups，and four principa1 componentsmake up 85.38% of the tota1variance.

KEY W 0RDS：Tetrastlgma hemsleyanum Die1s et Gi1g；ch1oroform extract；HPLC fingerprint；c1uster ana1ysis；principa1 component ana1ysis

三叶青Tetrastlgma hemsleyanum Die1s et Gi1g又名有角乌蔹莓、石老鼠、金线吊葫芦等，为葡萄科崖爬藤属植物，，可治疗高热、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病［1-2］，也是抗肿瘤常用药物［3-4］，含黄酮、有机酸和花青素类等多种活性成分［5］，其块根中分离并鉴定出的化合物有β-谷甾醇、胡萝卜苷、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷等［6］，为三叶青中重要的药效成分［7-8］。本课题组前期从中筛选出抗肝癌细胞毒活性最强的为氯仿提取部分，呈剂量依赖性地诱导肝癌HepG2细胞，呈现典型的凋亡特征性改变，并可改变其细胞周期分布，发生S期阻滞［9］。

大量研究表明，不同产区、品种三叶青有效成分的含有量及药理活性差异悬殊，如不同产地野生及栽培三叶青中总黄酮含有量相差最多7倍［10］，而个别产区几乎检测不到［11］，严重影响了临床疗效，故建立三叶青药材质量评价体系，以确保其临床应用显得极为迫切。目前，有关对三叶青药理作用和药材质量的报道仅以总黄酮或其中几个黄酮成分的定量分析为参考指标［12］，难以全面反映和区分该药材的整体质量。近年来，HPLC指纹图谱以其快速准确的特点，被广泛应用于中药生产、质量控制等方面［13］，其反映的化学成分，包括中药有效部位及种类，成为控制中药材质量的可靠技术，文献［14］对三叶青HPLC指纹图谱进行了初步探索，但其取样仅局限于浙江产区，而且未对共有化学特征峰等进行统计学分析，信息非常有限。为更全面地控制三叶青药材的质量，本实验建立了以其氯仿活性部位为基础的HPLC指纹图谱，测定17个不同产地的药材，并结合聚类分析和主成分分析［15］，对其模式进行识别研究，可为更全面评价该部位活性物质的质量提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Dionex U1timate 3000高效液相色谱仪，包括四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器；XS105DU电子分析天平（瑞士Mett-1er-To1edo公司）；6202高速粉碎机（台湾欣镇企业有限公司）；LABOIOTA 4000旋转蒸发仪（德国Heido1ph公司）；Mi11ipore Simp1icity超纯水机（美国Pa11公司）；SB-5200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 药材 三叶青药材由浙江省丽水市绿谷三叶青珍稀植物研究所提供，并经吉庆勇高级农艺师鉴定为三叶青Tetrastlgma hemsleyanum Die1s et Gi1g的块茎，样本保存于丽水市绿谷三叶青珍稀植物研究所，具体信息见表1。

1.3 试剂 乙腈（美国TEDIA公司）、甲醇（天津四友精细化学品公司）为色谱纯；氯仿、磷酸、95%乙醇为分析纯；水为超纯水。β-谷甾醇（批号ZN1113BA14）、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷（批号IF0228FA14）、槲皮素（批号TP60448FC23）对照品，均购自上海源叶生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agi1ent C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，20% A； 10～40 min，20～80% A；40～80 min，80～95% A）；体积流量1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。

表1 三叶青药材信息及相似度Tab.1 Information and sim ilarities of T.hemsleyanum samples

2.2 供试品溶液制备 药材除去杂质，自然晾干，高速粉碎过60目筛，精密称取3.0 g，置于250 mL圆底烧瓶中，精密加入95%乙醇70 mL，超声30 min（250 W、40 KHz），80℃水浴回流提取1.0 h，过滤，重复3次，合并滤液，浓缩挥干。加20 mL水超声溶解，100 mL石油醚（60～90℃）萃取1次，弃去石油醚部分，再用50 mL氯仿萃取3次，合并氯仿部分，浓缩挥干。甲醇定容于5 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。2.3 对照品溶液制备 精密称取β-谷甾醇3.06 mg、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷2.95 mg、槲皮素2.42 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，超声，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取湖北恩施产地（S7）三叶青药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样6次，以第6次进样所得指纹图谱为对照，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版），计算相似度。结果，相似度均不小于0.98，符合指纹图谱相关要求（不小于0.95）［16］，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取湖北恩施产地（S7）三叶青药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件于0、2、4、8、12、24 h检测指纹图谱，以第8 h进样所得指纹图谱为对照，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版），计算相似度。结果，相似度均不小于0.98，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取湖北恩施产地（S7）三叶青药材，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件检测指纹图谱，以第1次进样所得指纹图谱为对照，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版），计算相似度。结果，相似度均不小于0.98，表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立与技术参数

2.5.1 指纹图谱的建立 将17批三叶青药材按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，记录各产地三叶青的HPLC图。以AIA（*cdf）格式导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版），设定样品S10色谱图为参照图谱，对保留时间的色谱峰进行多点校正，自动匹配，时间宽度为0.1 min，经系统自动匹配，生成对照指纹图谱I，并建立17批次三叶青氯仿部位的指纹图谱，见图1。

图1 17批三叶青药材氯仿部位指纹图谱Fig.1 Fingerprints of the chloroform extract of 17 batches of T.hemsleyanum sam ples

2.5.2 共有峰的标定 根据17批次三叶青指纹图谱的检测结果，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版）的数据匹配功能，在对照指纹图谱上标定15个共有指纹峰（占总峰面积90%以上），见图2（A）。通过进样混合对照品，发现β-谷甾醇、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素在各产地样品图谱中均有发现，保留时间均一致，故确定2号峰为槲皮素，3号峰为山萘酚-3-O-新橙皮糖苷，15号峰为β-谷甾醇，见图2（B）。其中，4号峰分离度良好，保留时间适宜，故选为参照峰，而且各共有峰较稳定，具有指纹图谱特征，故拟定为三叶青药材氯仿活性部位的活性成分群。各产地药材的共有峰保留时间与相对峰面积见表2。

图2 样品和混合对照品的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram s of sam ples and m ixed reference substances

2.5.3 相似度评价 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版），计算17批三叶青药材氯仿活性部位HPLC指纹图谱的相似度，以生成的共有模式为对照，相似度在0.816～0.985之间，表明各产地药材氯仿部位均有良好的相似性。

2.5.4 三叶青药材聚类分析 以不同产地三叶青药材的15个共有峰峰面积为原始数据，SPSS19.0软件对药材进行系统聚类分析，采用组间平均数联结，以夹角余弦为样品相似度的距离公式，聚类分析结果见图3。由图可知，三叶青药材被分为5大类，Ⅰ类包括S3、S11、S12、S15；Ⅱ类包括S2、S10；Ⅲ类包括S4、S14；Ⅳ类包括S5、S6、S7、S13、S9、S8、S16、S17；V类包括S1。以各共有峰为变量，得到指纹图谱得分图，可见5类样品紧密地聚集在一起，而且各自分散在不同区域（图4），使不同产地三叶青药材之间得到了一定区分。同时，通过聚类分析发现，各产地三叶青药材之间的相关性与相似度分析结果较为一致。

2.5.5 三叶青药材共有峰主成分分析 主成分分析法是一种应用广泛的多元统计方法，用于简化数据，快速实现模式或关系的可视化识别［17］。SPSS 19.0软件对原始数据进行标准化处理，以主成分的特征值及贡献率为依据，对17个不同产地三叶青药材的15个共有峰（变量）进行主成分分析，结果见表3。

表2 共有峰的相对峰面积Tab.2 Relative peak areas of common peaks

图3 聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

图4 HPLC指纹图谱得分图Fig.4 Score p lots of HPLC fingerprint

表3 特征值表Tab.3 Table of characteristic values

由表可知，主成分个数的提取原则为其对应的特征值大于1，故取前4个（A1～A4）作为主成分，其累计贡献率达到85.38%。其中，第一主成分特征值为5.897，贡献率为39.311%；第二主成分特征值为3.321，贡献率为22.138%；第三主成分特征值为2.009，贡献率为13.394%；第四主成分特征值为1.581，贡献率为10.537%。

旋转后的公共因子载荷矩阵见表4，可知每个载荷量表示主成分与对应变量的相关系数。4个主成分与15个共有峰指标的线性组合模型如下，计算综合得分。

表4 旋转后的公共因子载荷矩阵表Tab.4 Load matrixes of postrotational common factors

A1＝-0.019 8P1-0.011 5P2-0.004P3＋0.010 3P4-0.031P5＋0.080 7P6＋0.061 0P7＋0.035 8P8-0.002 9P9＋0.075 8P10-0.041 6P11＋0.081 5P12＋0.185 0P13＋0.057 7P14-0.009 1P15

A2＝0.137 7P1-0.007 7P2＋0.148 2P3-0.016 5P4＋0.015 4P5-0.011 0P6-0.018 7P7＋0.040 1P8＋0.124 6P9-0.007 7P10-0.003 3P11-0.011 5P12-0.007 1P13-0.035 1P14＋0.084 5P15

A3＝0.014 8P1＋0.036 0P2＋0.010 6P3-0.043 7P4＋0.273 0P5-0.072 0P6＋0.065 6P7＋0.139 0P8＋-0.030 3P9-0.040 2P10＋0.319 6P11-0.086 8P12-0.077 6P13＋0.071 3P14-0.032 5P15

A4＝0.054 1P1-0.016 7P2-0.014 3P3＋0.410 4P4-0.109 8P5-0.060 4P6＋0.161 4P7＋0.007 2P8-0.222 7P9＋0.112 9P10-0.005 6P11-0.112 1P12-0.151 9P13＋0.153 5P14＋0.241 8P15

以第一、第二主成分为变量，得到二维投影图，见图5。以X轴为例，在投影图中选取距离原点较远的几个点，得到第一主成分中变量的权重值，权重值越大，该化合物在三叶青药材中的作用越大。其中，前5名变量的权重值分别为0.940、0.934、0.911、0.891、0.851，对应6、12、10、13和7号峰。从对照品色谱图可知，此5个峰为未知成分，需要进一步的分析确认。

3 讨论与分析

图5 HPLC指纹图谱的二维投影图Fig.5 2D projection map of HPLC fingerprint

3.1 实验条件的优化 本实验考察了超声提取、冷浸提取、加热回流以及超声加热回流4种提取方式，同时比较了60%、80%和95%乙醇的提取溶剂，发现以95%乙醇为提取溶剂，超声加热回流提取的效果最佳。再对甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液4组流动相系统进行筛选，发现乙腈-0.1%水溶液的梯度洗脱效果最佳，得到的色谱峰最多，峰型和分离度较好，基线平稳。在氯仿萃取之前，先用100 mL石油醚萃取1次，可有效去除三叶青醇提物中色素的干扰。同时，为尽可能多得到可供分析的色谱峰，应用紫外光谱对样品进行190～400 nm的全波长扫描，发现200～230 nm波段处有较大吸收，结合DAD检测器，对200、210、218、230 nm的波长进行考察，发现在210 nm处色谱峰信息较多，基线较平稳，色谱峰响应值相当。因此，选择检测波长为210 nm。

3.2 指纹图谱结果差异分析 建立全面、系统、特征性的指纹图谱，是三叶青质量评价的有效办法。通过建立17个不同产地三叶青氯仿部位HPLC指纹图谱，确定15个共有峰，以共有模式为对照，相似度在0.816～0.985之间，表现出良好的相似性，各色谱峰相对保留时间基本一致，符合指纹图谱要求，所含化学成分基本相同。但由表2可知，各成分的色谱峰有较大差异，说明有效成分含有量差别较大，各产地三叶青药材因品种资源、生态环境、生长年限、地域性等条件，均可能影响药材的品质，这为该药材的质量控制提供了参考。

3.3 聚类分析和主成分结果分析 由于相似度计算无法准确鉴定三叶青药材的产地来源，同时考虑各共有峰之间的差异，本实验再通过聚类分析和主成分进行统计学分析。其中，聚类分析能将不同基源的三叶青药材进行分类鉴定，结果分为5大类，如宁波鄞州、丽水莲都、遂昌和庆元产地的三叶青药材聚在一起，说明这4个产地三叶青的品种、生长环境、生长年限相当，同时其指纹图谱相似度接近。而且，它与相似度分析结果较为一致，得到了相互验证。

利用主成分分析，得到了4个主成分，累计方差贡献率为85.38%，说明这4个主成分可表达全部三叶青药材化学成分的85.38%，只有14.62%的信息丢失。其中，第一主成分方差贡献率最大，为39.31%，是三叶青药材最重要的成分群，它所包含的化学成分基本反映出各产地三叶青药材化学成分之间的相似性。另外，由于药材受生长环境、种质资源、经纬度等各因素的影响，其质量存在较大的差异，反映在色谱图上，就是在同一保留时间处有不同的峰面积。主成分分析能筛选出共有的特征成分，并指导发现决定性作用的化学成分，但本实验筛选出的特征成分未知，故需要结合质谱等手段作进一步确定。综上所述，运用聚类分析和主成分分析，可实现快速分析，发挥各自优势，互相验证和补充，多角度综合评判三叶青药材的质量。

4 结论

有关三叶青药材的指纹图谱研究较少，本实验建立了不同产地三叶青药材氯仿活性部位的HPLC指纹图谱，并对其化学模式进行识别。结果，样品的出峰数目、分离度均较理想，并标定出15个共有峰，对其中3个峰进行了确认，通过相似度计算、聚类分析和主成分分析，对药材进行综合评价，得到较理想的结果。同时，进行了HPLC方法学考察，发现精密度、稳定性、重复性都符合指纹图谱的要求，为三叶青药材的质量控制提供了更全面的参考。今后，本课题组将通过谱效学实验，进一步寻找三叶青药材“化学谱-药效”之间的对应关系，确定其质量控制的关键成分，构建三叶青抗肿瘤谱-效关系方程及生物活性指纹图谱。

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HPLC fingerprint of the chloroform extract of Tetrastigma hemsleyanum by cluster analysis and principal com ponent analysis

ZHANG Yu-jiong1， PENG Xin1，2 *， JIQing-yong3， GUO Qiao-sheng2

（I.ZheJiang Pharmaceutical College，Ningbo 3I5IOO，China；2.Department of Chinese Medicinal Materials，NanJing Agricultural University，Nan-Jing 2IOO95，China；3.Lishui Institute of Tetrastigma Hemsleyanum，Lishui323OOO，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish the HPLC fingerprint of ch1oroform extract of Tetrastigma hemsleyanum Die1s et Gi1g from different growing areas and to make c1uster ana1ysis and principa1 component ana1ysis.METH 0DS

*通信作者：彭 昕（1980—），女，硕士，副教授，研究方向为分子生物学。E-mai1：px4142@163.com

作者简介：张煜炯（1982—），男，硕士，实验师，研究方向为中药材质量控制。Te1：15958298818，E-mai1：sshhjj23@163.com

基金项目：浙江省中医药科技计划A类项目（2013ZA119）；浙江省教育厅科研项目（Y201432548）；浙江省新苗人才计划项目（2013I 433007）；浙江医药高等专科学校校级课题（ZPCSI 2014005）

收稿日期：2015-08-30

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.028

中图分类号：I284.1

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）03-0607-06