董 礼， 干建伟， 李 梅， 吴建国（雅安三九药业有限公司，四川雅安625000）



HPLC法快速测定参麦注射液指纹图谱

董 礼， 干建伟， 李 梅， 吴建国
（雅安三九药业有限公司，四川雅安625000）

摘要：目的 采用HPLC法，快速测定参麦注射液（红参、麦冬）指纹图谱。方法 分析采用Waters X-BridgeTMBEH Shie1d IP18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱；体积流量为2 mL/min；检测波长为230 nm；柱温为30℃；进样量为4 μL。检测10批参麦注射液，比较快速测定法与法定标准法的分析结果。结果 快速测定法与法定标准法的相似度基本一致。结论 该方法快速、准确、可靠，可取代法定标准中的指纹图谱检测法。关键词：参麦注射液；指纹图谱；相似度；HPLC

KEY W 0RDS：Shenmai Injection；fingerprint；simi1arity；HPLC

中药的化学成分复杂，很难使用一种或几种方法对其进行完全定量分析，而中药化学指纹图谱分析是对中药及其制剂进行综合宏观分析的有效方法之一［1］。2000年国家药品监督管理局颁布文件，要求对中药注射液建立药材和制剂的指纹图谱标准［2］。参麦注射液是以红参、麦冬为原料，经科学组方、合理配制、去除杂质后制成的中药复方注射剂，具有益气固脱、养阴生津、生脉的功效［3］，临床上多用于治疗气阴两虚型休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒细胞减少症［4-5］，该品种的新标准于2011年3月2日，由国家药典委员会审定，国家食品药品监督管理局颁布执行［6］，在原标准的基础上增加了指纹图谱相似度评价，对其质量稳定性、有效性的控制起着十分重要的作用。但该标准具有分析时间长的缺陷，难以保证分析过程中样品的稳定性。目前，化学指纹图谱的分析工具大多为高效液相色谱（HPLC）［7-9］，近年来关于超高效超快速液相色谱（UPLCUHPLC）的应用研究越来越多，其具有分析速度快、检测灵敏、结果准确的特点［10］，但因其价格昂贵，从而增加了分析成本。因此，利用传统的HPLC法，在保证分析结果准确的前提下，如何提高分析效率，是本实验研究的主要目的，从而为相关标准的进一步优化和建立提供依据。

1 仪器与材料

G1311B Agi1ent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；XA205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Mi11ipore Q纯水系统（美国密理博公司）。

中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）软件（国家药典委员会颁布）；Microsoft Office Exce12007软件（美国微软公司）；Medca1c统计软件（美国统计协会）。人参皂苷Ig1（批号110703-200726）、Ie（批号110754-200822）、Ib1（批号110704-200420）均购于中国食品药品检定研究院。参麦注射液共10批，由雅安三九药业有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XBridgeTM BEH Shie1d IP18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～6 min，0%→10%A；6～8 min，10%→23%A；8～10 min，23%A；10～17 min，23%→60%A；17～19 min，60%→100% A）；体积流量2 mL/min；检测波长203 nm；柱温30℃；进样量4 μL。

2.2 参照物溶液的制备 精密称取人参皂苷Ig1、Ie、Ib1适量，加20%乙腈制成每1 mL分别含0.10、0.08、0.20 mg样品的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取参麦注射液适量，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 对照图谱的制备 取参麦注射液的法定标准对照图谱，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”软件，导出数据文件。Microsoft Office Exce12007软件对导出数据文件中的保留时间除以5，保存，再导入相似度评价软件，保存对照图谱，即得。结果见图1。

图1 参麦注射液的对照图谱Fig.1 Reference fingerprint of Shenmai Injection

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取同一份供试品溶液，在“2.1”项条件下连续进样6次，测定特征峰（16个）相对保留时间和峰面积的ISD均小于2.5%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取同一批样品6份，在“2.1”项条件下分别进样，测得其特征峰（16个）峰面积相对保留时间和峰面积的ISD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在“2.1”项条件下分别于0、2、4、8、12、24 h进

行测定，其特征峰（16个）峰面积相对保留时间和峰面积的ISD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 耐用性试验 取同一份供试品溶液，在“2.1”项条件下于另外2台Agi1ent 1260高效液相色谱仪中进样，记录色谱图，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”软件计算相似度。结果，3个色谱图的相似度（16个特征峰匹配）均为1.00，表明仪器耐用性良好。

2.6 实验结果 取10批参麦注射液供试品，分别在“2.1”项条件下进样，记录色谱图。同时，将其按参麦注射液质量标准（标准号WS3-B-3428-98-2010Z）指纹图谱的检测方法进行分析，“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”软件计算相似度，利用B1and-A1tman分析，对比两种方法检测结果的一致性，结果见表1和图2。其中，± 2SD ofmean LSV的实线为±2倍法定方法所测10批指纹图谱相似度的标准偏差（-0.01，＋0.01），视为方法一致性评价的可接受界限；±1.96SD的虚线为95%的一致性界限，即以法定方法与快速测定法检测相似度的±1.96倍差值均数的标准差，下同。

表1 两种测定方法的相似度Tab.1 Sim ilarities of tWo determ ination methods

由图可知，10组数据的差值均在B1and-A1tman分析的一致性界限范围内，但偏离了可接受界限。因此可认为，快速测定法与法定标准法的相似度基本一致，但需要进行一定修正，才能使评价结果更一致，并且偏差可被接受。造成一致性界限偏离可接受界限的原因据推测，可能是两种方法检测相似度的差值均数较高（0.013），故以0.013为相似度修正值，将快速检测法的相似度＋0.013，再用B1and-A1tman分析，结果见图3。由图可知，修正后的一致性界限小于可接受界限，表明对该方法所测相似度进行修正后，与法定标准法一致，并且偏差可被接受。

图2 两种测定方法相似度的Bland-A ltman分析Fig.2 Bland-Altman analysis of the sim ilarities of tWo determ ination methods

图3 两种测定方法相似度的修正Bland-Altman分析Fig.3 Revised Bland-A ltman analysis of the sim ilarities of tWo determ ination methods

取两种方法指纹图谱中16个特征峰的峰面积，利用夹角余弦相似度公式［11］，计算相同样品不同方法所测指纹图谱特征峰的匹配相似度，结果见表1。由表可知，两种方法所测指纹图谱特征峰面积的相似度较高，达到0.96以上，表明快速测定法对16个特征峰峰面积比例的影响不大。

然后，比较两种检测法的色谱图，结果见图4。由图可知，快速检测法与法定标准法所测指纹图谱除保留时间发生较大变化外，其它色谱行为基本一致，即前者存在后者所测指纹图谱中的16个特征峰，并且出峰顺序一致，表明快速检测法对参麦注射液色谱行为的影响较小。

图4 两种测定方法的指纹图谱Fig.4 Fingerprints of tWo determ ination methods

3 讨论

快速测定法采用Waters X-BridgeTM BEH Shie1d IP18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.5 μm），该色谱柱为Waters公司推出的小粒径超高效液相色谱柱，硅胶颗粒通过亚乙基桥杂化。与硅胶基体的色谱填料颗粒相比，具有更宽的pH使用范围（1～12），而且使色谱柱具有更低的次级相互作用，峰形更好，柱效更高［12］。色谱柱粒径越小，塔板高度越低，柱效越高，并且减小填料的粒度也有利于发挥高流速的优势，可以在更宽的线速范围内使用［13］。该色谱柱以2 mL/min体积流量洗脱时，线速率约为2.00 mm/min，在2.5 μm粒径色谱柱的最佳柱效线速度范围内［13］。

使用该色谱柱时，需要解决传统的HPLC耐压问题。G1311B Agi1ent 1260 Infinity能够耐压600 bar，但实际快速分析时，柱压力最大只有380 bar，即其完全能满足快速分析要求。快速测定法指纹图谱的分析时间为19 min，相对于法定标准法（95 min）缩短了80%，大幅提高了分析效率，并降低了样品存放稳定性的风险。

采用B1and-A1tman统计分析时，能就两种测量方法对同一样本各测量一次的设计情形进行一致性评价［14］。通过计算两种方法结果之间的差异均数及其标准差，获得LoA，再根据其是否在可接受的误差范围内，用以判定两种方法之间的一致性。目前，应用B1and-A1tman一致限LoA，进行方法对比研究的一致性评价得到普遍认可［15］。利用B1and-A1tman统计法比较快速检测法和法定标准法对参麦注射液相似度评价的结果，发现前者可用于指纹图谱相似度评价，并且结果与后者一致。

参考文献：

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Rapid determ ination of Shenmai Injection fingerprint by HPLC

DONG Li， GAN Jian-wei， LIMei， WU Jian-guo
（Ya＇an SanJiu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Ya＇an 625OOO，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLC method for rapid1y determining Shenmai Injection（red ginseng and Ophiopogon Japonicas）fingerprint.METH 0DS The ana1ysis was performed on a Waters X-BridgeTM BEH Shie1d IP18 co1umn（4.6 mm×100 mm，2.5 μm），mobi1e phase was acetonitri1e-water with gradient e1ution，f1ow rate was 2.0 mL/min，detection wave1ength was set at203 nm，co1umn temperaturewasmaintained at30℃，and injection vo1ume was 4 μL.Then ten batches of Shenmai Injection were detected，and the resu1ts ana1yzed bybook=600,ebook=134rapid determination and 1ega1standard were compared.RESULTS The simi1arities of rapid determination and 1ega1standard were basica11y identica1.C0NCLUSI0 N Thismethod is rapid，accurate and stab1e，which can rep1ace the detection method of fingerprint in 1ega1standard.

作者简介：董 礼（1983—），男，硕士，助理研究员，从事中药质量标准研究。Te1：（0835）2228091，E-mai1：gsnhd1@hotmai1.com

基金项目：国家重大新药创制科技重大专项（2009ZX09502-030）

收稿日期：2015-05-12

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.026

中图分类号：I284.1

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）03-0599-04