李维前，季红菊，王玉莹，刘 霞

（徐州医科大学（原医学院）附属第三医院，江苏 徐州 221003）

原位杂交技术检测HPV-DNA的应用及体会

李维前，季红菊，王玉莹，刘 霞

（徐州医科大学（原医学院）附属第三医院，江苏 徐州 221003）

目的通过对活检标本检测HPV-DNA，得出原位杂交的应用体会。方法 通过原位杂交检测，结合其组织病理镜下形态特点作出总结分析。结果 降低了原位杂交假阳性和假阴性，得出一系列体会。结论 值得借鉴推广在原位杂交操作中的各个细节步骤中，应用这些体会提高原位杂交结果满意度。

原位杂交；技术；HPV-DNA；应用；体会

随着改革开放，人们一些不良生活方式的流入及社会经济水平的提高，一些疾病如妇科宫颈癌及癌前病变、女阴尖锐湿疣；男性阴茎尖锐湿疣、阴茎癌等在临床大量出现，这些疾病如果未经过系统规范的治疗，而造成病程反复,常常会给患者带来精神和身体的痛苦，也浪费了金钱时间。所以对这些疾病首先要明确诊断.现已证明这些疾病往往由人类乳头瘤病毒(HPV)感染而导致。原位杂交技术是目前国内检测HPV较先进的检测方法,该法是基于分子水平，检测人类乳头瘤病毒DNA。

1 资料与方法

1.1 一般资料

我科39例活检标本，其中宫颈12例，女阴部5例；男外生殖器16例，男阴部4例；其它部位2例。HPV试剂盒购自福建泰普生物科技公司。主要使用仪器有：上海森信实验有限公司的GRP-9080型隔水式恒温培养箱；泰普国际生物科学有限公司的M10061型杂交仪。

1.2 方法

1.2.1 杂交前处理：4um厚的组织切片经APES处理，65℃漂烘仪上烤片2h，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10分钟脱蜡，100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇各5分钟脱水处理，蒸馏水洗涤3分钟，然后移入盛有杂交增强液的塑料染色盒内、加盖微波炉高温处理15min（每隔5min补充杂交增强液，确保有足够的液体浸没组织），自然冷却至室温，蒸馏水洗涤1min2次，小心擦干组织周围液体。

1.2.2 原位杂交：（1）每张切片滴加适量杂交液50ul，加盖玻片于其上（配备专用，以防干片）（2）将切片放于原位杂交仪上95℃变性5min（3）取出切片放入含有30增效液的湿盒中37℃培养箱中过夜（＞16 h）。（4）取出切片，经48℃PBS液浸泡，轻微振荡自动脱掉盖玻片，再经48℃PBS液洗涤5分钟3次。

1.2.3 信号放大与显色：（1）在切片上加一抗50ul37℃水湿盒中孵育30min, 37℃PBS洗涤2 min3次（2）加二抗50ul室温水湿盒中孵育20min, PBS洗涤2 min3次（3）加50ulHRP聚合物室温水湿盒中孵育30 min ，PBS洗涤2 min3次（4）加50ulDAB显色液，室温镜下控制显色，PBS洗涤2 min3次（5）流水充分洗涤，苏木精复染，盐酸乙醇分化，返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结 果

阳性信号为上皮细胞核呈棕褐色。39例标本（宫颈

12例，女阴部5例；男外生殖器16例，男阴部4例；其它部位2例）HPV检测结果：阳性27例(阳性率69%)，阴性

12例。其中宫颈标本阳性9例（阳性率75%），男生殖器阳性10例（阳性率62.5%）。女阴部阳性3例（阳性率60%），男阴部阳性2例（阳性率50%）。其它部位阳性2例（阳性率

100%)。

3 讨 论

HPV属于乳多孔病毒科的乳头瘤病毒属，是无包膜的20面体对称的核衣壳结构，表面有72个壳微粒。病毒基因组呈双股环状DNA，主要通过直接或间接污染物品或性传播感染人类，引起人类皮肤黏膜的多种良性乳头状瘤或疣，某些个别感染具有致癌性。根据病毒促进细胞癌变能力分为2种：低危型和高危型。低危型主要引起良性外生疣、低度宫颈上皮内瘤变；高危型主要引起高度宫颈上皮内瘤变、外生殖器癌、宫颈浸润型鳞癌等。HPV检测现有多种方法，其中最常用的免疫组化法根据抗原抗体免疫反应的原理检测抗原，只能有助于确定有无感染；而原位杂交法根据核酸变性、复性原理可确定宫颈上皮内瘤变的级别，并且准确定位待测物，兼具半定量的功能[1]，具有敏感性高、特异性强的优点，因此，分子水平的原位杂交检测法优于蛋白水平的免疫组化法。

但原位杂交技术检测HPV步骤多，操作要求高，常常出现掉片，假阴性、假阳性、背景染色过重等现象。对此，（1）用防脱片捞取切片并65℃烤片2h，使组织与玻片充分粘附，时间不能过短，并且操作每一步都要动作轻轻，做到谨小慎微以防掉片。（2）切片脱蜡、脱水、杂交增强液微波炉高温处理要充分彻底；一抗、二抗、HRP聚合物、DAB量要足够，时间和温度要达要求，以免假阴性或阳性不足（3）切片要保证4um厚，不能过厚,否则易脱片或者染色过强；杂交液、一抗、二抗、HRP聚合物、DAB等的量不能多，反应时间不能过长，否者造成假阳性或背景深阳性过强；并严格洗涤时间和次数，保证洗涤干净以免非特异性着色造成染色过重甚至假阳性。（4）切片经过高温处理，多次洗涤等许多步骤容易掉片。（5）杂交过程使用30%增强液的湿盒而不是盛有水的湿盒，目的是降低水分对探针稀释的可能，同时避免了因水分蒸发而致浓度过高造成背景染色过重[2]（6）杂交后PBS洗涤温度不能过低，应保证48℃，否则不能充分去除非特异性杂交。建议用恒温箱，保证洗涤温度[3]恒温箱设定温度应大于48℃，温箱里放置温度计以便测量实际箱温，保证切片不低于48℃。（7）盖玻片大小要匹配，加杂交液不能过多或过少，过多盖玻片会滑动而使杂交液蒸发；过少会产生气泡，不能完全覆盖组织，杂交效果不理想。（8）杂交前预处理非常重要，微波处理中应保持足够的杂交增强液幷加盖，每隔5min添加增强液防止干片。（9）DAB显色时，应现用现配，镜下控制显色时间，达到最佳效果。（10）杂交后的切片经48℃PBS液浸泡，轻微振荡自动脱掉盖玻片，不得用镊子剥掉以防组织脱掉。（11）切片不能厚于4um，否则易脱片或者染色太重。[4]（12）苏木精复染要淡染，以免染色深遮盖了DAB的显色。（13）操作人员带一次性手套、口罩等，避免RNA酶污染。[5]（14）标本固定及时充分，越早固定越好，防止标本变性自溶、HPV-DNA丢失而致假阴性或阳性减弱。新鲜标本立即入4%中性缓冲甲醛内固定，防止基因降解，出现无杂交信号或信号微弱。

原位杂交技术检测HPV可以明确病变组织是否是由HPV感染引起，如果是HPV感染，临床就必须有针对性的对患者长期、系统、规范治疗，以便于患者了解疾病情况做好有针对性的配合，避免治疗的盲目性和花冤枉钱，更为重要的是有效切断癌变进程，防止进一步发展成癌症（如阴茎癌、宫颈癌等）。因为人乳头瘤病毒（HPV)与一些良性疾病（如生殖器疣，尖锐湿疣）和肿瘤性病变（如上皮内瘤变，宫颈癌、阴茎癌）密切相关[1]，HPV感染是这些疾病发生的必要条件。而不是不问青红皂白，见疣、见瘤一烧了之，或切掉大吉，不做常规病理，更不查HPV，等疣复发后再切，对患者不负责任，造成患者不必要的痛苦[4]。但也不要见HPV色变，如果只是一过性的感染或者低危型HPV感染且个人身体免疫力强经过规范治疗则会康复，因为只有HPV多次长期持续感染则会致瘤致癌。

但该项目要以常规病理的形态学为基础，根据细胞内是否有空泡等形态异常来确定是否做原位杂交检测HPV，以防滥用原位杂交而增加患者不必要的经济负担。本法是基于病因学，是查疾病的致病源。常规病理和原位杂交检测HPV要相结合，有时还要进行DNA倍体分析等检测来诊断。

[1] 杨 彬.HPV检测及分子标记在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的应用[J].诊断病理学杂志,2009,16(4):320.

[2] 周 伟,耿建祥,韩惦梅.原位杂交HPVDNA检测技术应用及体会[J].临床与实验病理学杂志,2009,25(4):446-447.

[3] 熊红梅,邱晓明.原位杂交HPVDNA制片技术常见问题分析[J].诊断病理学杂志,2011,18(1):70.

[4] 邓国华,张 洵.人乳头瘤病毒与宫颈癌[J].诊断病理学杂志, 2009,16(6):469.

[5] 王 颖,陈定宝,沈丹华.常规病理诊断中应用原位杂交和免疫组化方法检测EB病毒的体会[J].诊断病理学杂志,2011,18(2):160.

R373

A

ISSN.2095-8803.2016.10.029.02