文/山东省滨州畜牧兽医研究院 庄金秋 梅建国 李 峰 姚春阳 马 力

猪呼肠孤病毒的特征及检测技术研究进展

文/山东省滨州畜牧兽医研究院 庄金秋 梅建国 李 峰 姚春阳 马 力

仔猪病毒性腹泻一直是困扰养猪业健康发展的重要因素。猪呼肠孤病毒(Porcine reovirus，PRV)属呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属成员，是仔猪病毒性腹泻的主要原因之一。PRV在猪群中广泛存在，对猪具有一定的致病性。另外，健康猪群体内也会存在PRV。PRV感染未吃初乳的初生仔猪会引起猪的体温升高以及腹泻等症状。由于PRV感染猪的致病机制尚不明确，因此目前还没有特异性的预防和治疗该疾病的方法。本文概括了PRV的病毒特征及检测技术，以期对疾病的预防和控制提供参考。

1 病毒的由来和发现

目前报道的猪呼肠孤病毒共有3个血清型，其中I型由Kasza等(1970)和McFerran等(1970)分别分离报道；Ⅲ型由Robl等(1971)分离报道；Ⅱ型由Fukutomi等(1996)在日本首次分离报道。曾志勇等(2006)在国内首次从猪体内分离得到了Ⅲ型哺乳动物呼肠孤病毒SC-A株，随后，Zhang等(2007)也分离得到一株Ⅲ型的哺乳动物呼肠孤病毒MRV-HLJ/2007株，Kwon等(2011)从韩国78个猪场237份腹泻样品中检出了45份Ⅲ型哺乳动物呼肠孤病毒阳性(检出率达19%)，并且从阳性病料中分离得到10株Ⅲ型哺乳动物呼肠孤病毒。从患有呼吸道疾病或胃肠道疾病的猪、临床健康的猪、流产胎儿等都可分离得到呼肠孤病毒。实验接种有时不会发病。

2 病毒的分类地位

猪呼肠孤病毒为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属成员，为分节段的双链RNA病毒。已知呼肠孤病毒科(Reoviriche)是一个庞大的病毒科，有9个既定属和2个拟定属，能广泛地侵染自然界中各种生物有机体，并可导致机体产生各种病理反应。其中，哺乳动物呼肠孤病毒(Mammalian Reovirus，MRV)，主要感染人和哺乳动物（如猪、牛、马、犬、猫、鼠等）的呼吸道或消化道，对动物具有广泛的致病性。猪呼肠孤病毒是MRV的一种，无囊膜，具有特征性的20面体对称双层衣壳结构。完整的病毒粒子直径为76nm左右，核心的直径约52nm。

3 流行病学特点

呼肠孤病毒是一类既能感染呼吸道，又能感染胃肠道的病毒，猪群中流行普遍。几乎所有的猪都可检测到3种血清型的抗体。病毒经口感染或经呼吸道感染。被动抗体在新生仔猪体内可存在11周左右，之后任何年龄的猪对呼肠孤病毒均有易感性。

4 临床症状

呼肠孤病毒在接种24h后由鼻腔分泌物和粪便排出，可持续6～14d。通常断奶仔猪鼻内接种或接触由气溶胶传播的I型呼肠孤病毒，表现轻微的呼吸道症状，主要特征是发热、打喷嚏、食欲不振、精神沉郁等。呼肠孤病毒Ⅲ型经静脉或肌肉注射血清呈阴性的，若40～85d的经产母猪感染，可导致木乃伊胎、死胎、弱胎等。可从经产母猪的流产排泄物和胎盘中分离得到病毒。

5 病理变化

所有猪呼肠孤病毒的动物试验均表明其不会导致受感染仔猪产生明显的临床症状，但可对肺脏或肠上皮细胞产生轻微损伤。呼肠孤病毒接种的研究表明，感染后很少有全身性病理变化，一般只显示轻微的显微病理变化。I型呼肠孤病毒以气溶胶的形式感染4周龄的SPF仔猪，不会导致全身性病理变化，但可引起一致的肺部显微病变——淋巴细胞和巨噬细胞在肺泡和肺泡间隔多灶性集聚，及支气管淋巴细胞肥大性增生。70kg的SPF猪经鼻内接种呼吸道分离的Ⅲ型呼肠孤病毒，可导致肺泡性肺气肿、支气管结节状淋巴细胞肥大性增生，各肺小叶之间程度不同。

6 病毒的致病机制

猪呼肠孤病毒在猪群中广泛存在，对猪具有一定的致病性。猪呼肠孤病毒感染初生仔猪后，可能会引起仔猪的体温瞬间升高、腹泻，甚至是肺部的纤维化。而有些仔猪感染后，仅表现出亚临床经过，但还能从仔猪粪样中再次检测到病毒。呼肠孤病毒主要是在自然感染猪的呼吸道和肠道中复制。呼肠孤病毒的致病机理和病理变化目前主要是用小鼠来研究，所取得的进展对于病毒及病毒与宿主间的作用很有意义。小鼠感染呼肠孤病毒后可引起心肌炎，这与呼肠孤病毒侵入后可引起无明显炎症反应的心肌细胞损伤有关。尽管猪呼肠孤病毒是否造成仔猪腹泻与诸多因素有关，但因其与人呼肠孤病毒同属MRV，不能排除人畜共患的可能，故需谨慎对待呼肠孤病毒，应对呼肠孤病毒与动物和人类疾病的关系等作进一步研究。

7 病毒的检测技术研究进展

目前已知的猪呼肠孤病毒所致的临床症状和病理变化都不具有特征性，因此，该病的诊断有赖于实验室检测。

7.1 病毒分离与鉴定

虽然该病毒存在于病猪粪样、呼吸道分泌物、肺、脾等组织中，但发病后8～12h内的粪和呼吸道分泌物的检出率最高，而粪便是样品采集的首选。该病毒对多种细胞系以及多种原代细胞都能适应，并产生细胞病变(CPE)。哺乳动物的血清均可能含有抗呼肠孤病毒的抗体，分离前要除去。曾志勇等(2008)通过在病毒培养液中添加胰酶的方法，用Vero细胞进行病原分离，结果分离到1株能在该细胞上稳定产生明显CPE，即以细胞颗粒增多、肿胀、漂落为特征的分节段的双链RNA病毒，经系列鉴定后证实为猪呼肠孤病毒，并命名为猪呼肠孤病毒SC-A株。何小明(2013)通过在细胞培养液中添加胰酶的方法，从仔猪腹泻粪样中分离到猪源I型呼肠孤病毒SHR-A株。呼肠孤病毒可通过两种途经感染细胞：①通过病毒粒子吸附于细胞表面的受体分子，在受体介导的胞吞作用下侵入细胞，并借助溶酶体中一些蛋白酶降解其外衣壳，生成具有感染性的次病毒颗粒(ISVP)；②部分病毒粒子在胞外经蛋白酶降解生成的ISVP后直接侵入细胞，此时则不依赖于受体介导的胞吞作用。可能正是因为在病毒培养液中添加了胰蛋白酶，从而减少了病毒对细胞及其受体的依赖，并最终成功分离得到病毒株。

7.2 血清学方法

7.2.1 血凝抑制试验(HI) Ⅰ型和Ⅱ型猪呼肠孤病毒均有凝集人红细胞的显著特性，Ⅲ型呼肠孤病毒能凝集牛红细胞，并比凝集人红细胞的滴度高。这2种动物的红细胞是该病毒血凝试验的主要材料。另外，该病毒能凝集猪红细胞，不能凝集豚鼠和鸡红细胞。该病毒的凝集作用可被同型血清有效抑制。因此，一般用血凝抑制试验鉴定其血清型别。

7.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) 中国广东分离株GD-1属于血清Ⅲ型，该病毒含有10条分节段基因，其中编码σ1蛋白的为Sl基因。研究表明，σ1蛋白是一种细胞的吸附蛋白，也是一种血凝素，虽然其仅占病毒颗粒的比重为2%，但它是引起特异性的抗病毒免疫反应作用的关键蛋白，能够介导病毒与细胞受体的结合，与特异性的血清型抗体相结合，因而可以应用于抗体的检测。刘启亮等(2016)采用PCR方法扩增PRV GD-1株S1基因，并以原核系统表达其编码的σ1蛋白。以纯化的σ1蛋白作为包被抗原，鹅抗猪IgG-HRP为检测抗体，建立了PRV血清型Ⅲ型间接ELISA血清学的检测方法。应用该法和同类ELISA进口抗体检测试剂盒对606份临床样品进行检测，两者符合率为96.2%。该方法的建立为进一步开发商品化试剂盒奠定了基础。

7.3 分子生物学方法

PCR具有快速、敏感、特异等优点，已被广泛应用于PRV的实验室检测。2011年底以来，我国很多省市初生仔猪出现腹泻性疾病。病猪以腹泻、脱水、厌食、迅速消瘦为主要特征。一些研究结果显示，其主要病原包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒和博卡病毒等。为了进一步研究该类疾病的病原流行毒株特性，陈兴慧等(2012)研究采用上述31个规模猪场102份腹泻病料样品，应用RT-PCR检测PRV，结果REOV的猪场阳性率为45.16%，病料样品阳性率为26.47%。选择2份病料无菌处理后接种Vero细胞，维持液中添加5μg/mL胰酶，传代2～3次，出现CPE，经过RT-PCR扩增和基因序列分析，病毒粒子负染电镜观察，证明其为PRV，命名为ZJ120101和AH120411毒株。谈晨(2013)通过RT-PCR方法从仔猪腹泻病料中检测出PEDV和PRV，PEDV猪场阳性率67.74%，病料样品阳性率46.08%，PRV的猪场阳性率为45.16%，病料样品阳性率为26.47%，丰富了我国仔猪腹泻病原流行病学资料。何小明(2013)用套式RT-PCR检测2010年1月～2012年12月送检的不同猪场病料，并对其中45份阳性病料的核酸进行浓缩后用根据S1基因设计的型特异性的引物进行RT-PCR，同时将扩增产物纯化并克隆至T载体经测序后进行进化分析。进化分析结果表明这些毒株分属血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅲ型毒株为优势流行毒株，流行范围覆盖大陆绝大部分地区。另外，其他分子生物学检测技术，如荧光定量RT-PCR、核酸探针技术及核酸的PAGE电泳鉴定等也被相继应用于猪呼肠孤病毒的检测。这些技术的应用为新的检测方法的建立、流行病学监测以及有效的防控措施制定提供了理论基础。■

略）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-08-17)；山东省重点研发计划项目(2015GSF121027)。