邱 菡，周红祖，周禹练，余惠旻△

(1.深圳市第二人民医院，广东 深圳 518035;2.深圳市中医院，广东 深圳 518020; 3.深圳大学医学院，广东 深圳 518060)

左金方联合5-FU抑制人胃癌细胞RF-48的增殖作用研究*

邱 菡1，周红祖2，周禹练3，余惠旻3△

(1.深圳市第二人民医院，广东 深圳 518035;2.深圳市中医院，广东 深圳 518020; 3.深圳大学医学院，广东 深圳 518060)

目的:研究左金方联合5-FU抑制胃癌RF-48细胞增殖，探讨其协同增效作用。方法:Cell Counting Kit-8检测细胞增殖率的变化，流式细胞仪检测细胞凋亡，Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化。结果:左金方对HFE145细胞活力的影响很小，而小剂量的5-FU会引起较大的细胞毒性，不同浓度左金方、5-FU均能诱导RF-48细胞的凋亡;左金方联合5-FU后对HFE145细胞存活率的影响，以及对RF-48细凋亡率的影响，与单独用药组比较差异有统计学意义，Hochest染色RF-48细胞出现核固缩状和颗粒状荧光等典型的凋亡学特征。结论:左金方与5-FU联合用药大幅降低了5-FU的细胞毒性作用，显著提高了HFE145细胞的存活率，促进了人胃癌细胞RF-48的凋亡，比左金方或者5-FU单独用药对胃癌的治疗效果更好。

左金方;5-FU;HFE145;RF-48;联合用药;凋亡

中国是胃癌的高发区［1-2］，目前胃癌的化疗药物泰素、多西紫杉醇、伊利替康以及各种5-氟尿嘧啶(5-FU)衍生物等虽能使胃癌的化疗效果显著提高，但其存在严重的毒副作用［3］。在化疗中，某些中药配合治疗胃癌可以直接抑制肿瘤细胞的增殖，还可以减轻化疗的毒副作用，但目前尚无具有广泛治疗作用的临床中药制剂问世。左金方是出自《丹溪心法》的名方，临床常用于急慢性胃炎和消化性溃疡的治疗［4］。近年来研究还发现，它具有抗肿瘤作用［5-9］。本研究在前期研究的基础上，采用体外培养人正常胃黏膜上皮细胞HFE145和人转移性胃腺癌细胞株RF-48的方法，探讨左金方和5-FU对胃癌细胞的协同增效作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CO2培养箱(美国 Shella公司);DC300型倒置荧光相差显微镜(德国Leica公司);超净工作台(比利时Esco公司);Rotofix32型离心机(德国 Hettich公司);AllegraTM21R型低温离心机(美国Coulter公司);Epics XL型流式细胞仪(美国 Coulter公司); Polar star Galaxy型酶标仪(德国BMG公司)。

1.2 主要药物与试剂

黄连、吴茱萸均购于深圳华辉药业有限公司，由深圳市中医院中药科刘志诚主任药师鉴定，分别为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch.的干燥根茎和芸香科植物吴茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss) Benth.干燥近成熟的果实。Cell Counting Kit-8 (CCK-8，日本同仁化学研究所 Dojindo)、碘化丙啶(PI)、RNA酶(RNase)均购自美国 Sigma公司; DMEM培养基、胰酶(trypsin，美国 Gibico公司);胎牛血清(FBS，美国 Hyclone公司);Hoechst 33258 (瑞士Fluka公司);5-氟尿嘧啶(5-FU，天津金耀氨基酸有限公司，批号 1412011);Alexa FluorR 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (美国Lifetechnology公司)。

1.3 细胞

人胃黏膜上皮细胞 HFE145、人转移性胃腺癌细胞RF-48购自深圳大学医学院细胞中心(细胞源自美国ATCC细胞库)。

2 方法

2.1 药物制备

左金方传统汤剂冻干粉:由本实验室提供，取30 g黄连与5 g吴茱萸，加8倍蒸馏水浸泡30 min，加水煎煮3次，每次30 min，过滤合并3次滤液，冷冻干燥，每克干粉含生药3.98 g;经 HPLC法测定，左金方冻干粉中含小檗碱39.85%，巴马汀9.19%，药根碱 4.86%，吴茱萸碱 0.17%，吴茱萸次碱0.19%。将左金方冻干粉溶于去离子水中，配置成1 mg/mL的母液，实验时用细胞培养液稀释成所需浓度。5-FU的配制方法:取适量5-氟尿嘧啶注射液原液加细胞培养液配制成1 mg/ml母液，实验时用细胞培养液稀释成所需浓度。

2.2 细胞培养

HFE145人正常胃黏膜上皮细胞、RF-48人转移性胃腺癌细胞在10%小牛血清DMEM培养液中，于37℃条件下，在湿度为100%、含CO2为5%(体积分数)的CO2培养箱中常规培养。

2.3 观察指标和方法

2.3.1 CCK-8检测细胞活性 取人正常胃黏膜上皮细胞HFE145对数生长期细胞，用DMEM培养基制成细胞悬液(5×104/mL)加入96孔板，100 μL/孔，培养12 h后给药，实验组分别加入不同浓度的供试药物，分别培养24、48 h，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(OD)。其中将未经处理的对照组细胞存活率设定为100%。细胞抑制率=(1-实验组平均 OD值/对照组平均 OD值)× 100%。

2.3.2 流式细胞仪检测 调整人胃腺癌细胞RF-48细胞密度为2×105/mL，以1.5 mL/well种入6孔板，每组6个复孔。药物作用24 h后，细胞刷刮取细胞，800 r/min离心5 min，去上清加入 PBS重悬，调整细胞浓度为1×106/mL。取适量于流式管中，加入工作液 500 uL，再加入荧光染料(10 uL Annexin V-FITC和5uL PI混合液)，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，室温避光染色15 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率(激发光波长用 488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测 FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI)。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以右下代表的早期凋亡率加右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞凋亡率。

2.3.3 Hochest染色 －荧光显微镜观察 将RF-48细胞(2×105/mL)接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予不同的处理因素后，加入新鲜配制的4%多聚甲醛(pH为7.4)，于37℃固定细胞30 min，PBS液洗2次，加5 mg/L Hochest 33258染色液染色 30 min，PBS液洗后，用封片液(20 mmol/L柠檬酸，50 mmol/L磷酸氢二钠，50%甘油，pH 5.5)封片后荧光显微镜观察、摄片。

(4)边坡开挖预裂孔残留孔率控制：①在开挖轮廓面上，残留孔痕迹应均匀分布；残留孔痕迹保存率，对完整的岩体，应达到85%以上；对较完整和较破碎的岩体，应达到60%以上；对破碎的岩体，应达到20%以上。

2.3.4 统计学方法 采用 SPSS 1010统计软件进行统计分析，数据以均数 ±标准差 (±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 药物对HFE145细胞存活率的影响

3.1.1 左金方对 HFE145细胞存活率的影响 CCK-8实验结果显示，左金方对HFE145细胞活力的影响很小，小剂量左金方能促进细胞的增殖和分裂，当给药浓度增加到一定程度后，随着给药浓度的增加和作用时间的延长，细胞活力稍有减弱。图1显示，1.00 ug·mL－1左金方作用HFE145细胞24、48 h的细胞存活率分别为(106.68±1.65)%和(100.16±1.23)%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 不同浓度左金方作用不同时间对HFE145细胞存活率的影响(n=6)

3.1.2 5-FU对HFE145细胞存活率的影响CCK-8实验结果显示，对照组细胞生长良好，5-FU对HFE145细胞活力的影响呈现“浓度-时间依赖性”的关系，即随着给药浓度的增加和作用时间的延长，细胞活力逐渐减弱，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。图2显示，小剂量的5-FU会引起细胞毒性，随着用药浓度增加其毒性亦增强。

图2 不同浓度5-FU作用不同时间对HFE145细胞存活率的影响(n=6)

3.2 药物对RF-48细胞凋亡的影响

表1、2显示，不同浓度左金方、5-FU作用于RF-48细胞，随着给药浓度的逐渐增高和给药时间的延长，RF-48细胞的凋亡率逐渐增大，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1 不同浓度左金方作用24 h对RF-48细胞凋亡率的影响(%)

表2 不同浓度的5-FU作用24 h对RF-48细胞凋亡率的影响(%)

3.3 联合用药对 HFE145和 RF-48细胞生长的影响

3.3.2 联合用药对 RF-48细胞凋亡的影响图3、4显示，从流式细胞的检测结果可以看出，1.00 ug·mL－1左金方分别与50.00 ug·mL－1、100.00 ug· mL-15-FU联合用药作用于RF-48细胞24 h后，细胞凋亡率大幅度提高(前期和中后期都有增加，以中后期占主导)，联合用药组与左金方和5-FU单独用药比较差异有统计学意义(P＜0.05)，即联合用药组诱导凋亡的作用优于各单独用药组。

表3 左金方与5-FU联合用药作用不同时间对HFE145细胞存活率的影响

图3 各组Annexinⅴ/PI凋亡检测图

3.4 左金方和5-FU单独与联合对人胃癌RF-48细胞形态学的影响

从实验结果可看出，经Hoehest33258荧光染色后，荧光显微镜下见空白组RF-48细胞膜均完整，核形态饱满，核质着色浅，密度均匀一致(图 5A); 1.00 ug·mL－1左金方、50.00 ug·mL－15-FU、100.00 ug·mL－15-FU作用24 h后，细胞出现典型凋亡形态特征，细胞膜皱缩，细胞核相对变小，荧光明显增强，呈高度块状(图5B、5C、5D);左金方 +5-FU(1.00 +50.00)、左金方+5-FU(1.00+100.00)联合用药作用24 h，细胞除上述特征外，可见凋亡小体数目明显多于各单独用药组(见图5E、5F)。

图4 各组肿瘤细胞凋亡率图

图5 左金方和5-FU单独与联合对人胃癌RF-48细胞形态学的影响(×200)。

4 讨论

胃癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程。大量的研究证明，中药配合化疗治疗胃癌可明显改变症状，增加有效率，延长生存期，防复发、抗转移，平衡和调节机体内环境，提高与改善机体免疫能力，保护重要器官功能，减轻化疗毒副反应，提高生存质量［10-12］。我们前期研究也发现［7-9］，左金方能诱导胃癌细胞SGC-7901(胃中分化腺癌细胞系)和MGC803 (胃低分化腺癌细胞系)的凋亡，联合5-FU后能显著提高正常组织细胞的存活率，大幅降低5-FU的毒副作用，其作用优于左金方或5-FU单独用药组。

本研究选用HFE145(人正常胃黏膜上皮细胞)和RF-48(低分化、高转移)开展以上研究。CCK-8的结果显示，药物作用 HFE145细胞24 h后，左金方对细胞活力的影响很小，5-FU有显著的细胞毒性作用，二者联合用药后，显著提高了正常胃黏膜上皮细胞的存活率，大幅降低了5-FU的毒副作用。流式细胞仪的检测结果显示，左金方和5-FU均能诱导胃癌细胞RF-48的凋亡，二者联合用药后，能显著促进胃癌细胞RF-48的凋亡，其作用优于左金方和5-FU单独用药。Hoehest33258荧光染色从形态学角度进一步证明，左金方与5-FU联合用药比左金方或5-FU单独用药对胃癌的治疗效果更好。

目前，5-FU是临床消化系统中胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、食管癌等普遍使用的化疗药物，长期使用会产生耐受，且5-FU毒副作用大，大剂量使用会增加病人的痛苦。本研究发现，左金方具有促进RF-48细胞凋亡的作用，并随药物浓度的升高而增强。左金方联合5-FU作用于RF-48细胞会产生协同作用，其作用机制尚不明确。本研究成果对降低临床抗胃癌化疗药物的毒副作用，提高治疗效果，开发可用于临床治疗胃癌的左金方复方制剂，都具有重大的临床意义。

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Study on the Effect of Zuojin Decoction Combined With 5-Fu Inhibits the Proliferation of Human Gastric Cancer Cell Line Rf-48

QIU Han1，ZHOU Hong-zu2，ZHOU Yu-lian3，YU Hui-min3△
(1.Shenzhen Second People's Hospital，Shenzhen 518035，China;2.Shenzhen Chinese Medicine Hospital，Shenzhen 518020，China;3.School of Medicine，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China)

Objective:To investigate the synergistic effect of ZuoJinFang combined with 5-Fu on inhibiting the cell prociferation of Human Gastric Carcinoma RF-48 cells.Methods:The growth inhibitions of HFE145 cell were analyzed by MTT assay，the apoptosis rates of RF-48 cell were studied by flow cytometry，and the cell morphology changes of RF-48 cell were showed by Hoechst 33258 staining.Results:ZuoJinFang has little impact on the cell viabilities，and 5-FU causes larger cell toxicity at low doses.The RF-48 cell apoptosis can be induced by both ZuoJinFang and 5-FU.After the cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00+50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the influences not only on HFE145 cell survival rate but also on RF-48 apoptosis rate，compared with ZuoJinFang and 5-Fu group separately，the differences were statistically significant.Hochest staining results showed RF-48 cells nuclear condensation，granular fluorescence and other typical features of apoptosis.Conclusion:ZuoJinFang combined with 5-FU，greatly reduced the side effects of 5-FU，significantly increased the survival rates of the Human Gastric Mucosal Epithelial Cell HFE145 cells，promoted apoptosis of gastric carcinoma RF-48 cells，and the effects of drug combination were stronger than ZuoJinFang or 5-Fu separately under the same conditions.

ZuoJinFang;5-FU;HFE145;RF-48;Drug combination;Apoptosis

R285.5

:B

:1006-3250(2016)07-0929-04

2016-01-14

广东省中医药局项目(20141253)-左金方颗粒剂与汤剂诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的实验研究

邱 菡(1982-)，女，广东人，主管药师，从事临床药学研究。

△通讯作者:余惠旻(1972-)，男，新疆人，医学博士，药学硕士，从事中药及其复方抗肿瘤的临床与研究，Tel:0755-86671902，E-mail:yuhuimin@szu.edu.cn。