林 静，卢 群，杨泽民△

(1.广东药科大学基础学院，广州 510006;2.嘉应学院医学院，广东 梅州 514031)

采用唾液淀粉酶活性指标对脾虚模型大鼠唾液采集方法的评价研究*

林 静1，2，卢 群1，杨泽民1△

(1.广东药科大学基础学院，广州 510006;2.嘉应学院医学院，广东 梅州 514031)

目的:评价脾虚模型大鼠唾液采集方法的可行性。方法:采集利血平所致脾虚组大鼠和正常组大鼠各24例酸刺激前后的唾液，其中刺激后的唾液以0.4 mol/l 0.50 cm×0.50 cm柠檬酸滤纸，每隔2.5 min刺激大鼠舌尖30 s，获得刺激后0～5 min、6～10 min和11～15 min的唾液。Bernfeld法测定唾液淀粉酶(sAA)活性，计算sAA活性比值。结果:脾虚组衰竭明显，体质量比正常组显著降低;正常组与分组前所有大鼠刺激前和刺激后sAA活性及其活性比值比较差异无统计学意义;脾虚组酸刺激前的sAA活性与正常组比较差异无统计学意义，酸刺激后3个时间段的sAA活性和活性比值均比正常组显著降低。结论:建立唾液采集方法经sAA活性分析，表现出与人较为一致的趋势，可以用于脾虚大鼠sAA相关研究。

唾液淀粉酶;酸刺激;脾虚大鼠;唾液采集

中医认为“脾开窍于口”、“脾主涎”、“脾在液为涎”等，涎为口腔津液，是唾液中较清稀的部分，具有润泽口腔、保护口腔黏膜的作用，在受到刺激如进食时分泌量增多，以助食物吞咽和消化吸收，脾胃调和时唾液分泌适量。在论述脾的病理时，把“多流涎”作为脾虚证重要的证候之一。另外，从临床辨证、治疗等方面均发现，脾与唾液关系密切。唾液淀粉酶(sAA)作为唾液中最为丰富的蛋白［1］，常被用来作为考察唾液蛋白分泌的主要指标。临床研究显示，柠檬酸刺激后健康人和脾虚患者sAA活性均增加，但脾虚患者 sAA活性比值比健康人显著下降，这一结果作为脾虚证临床辨证的一项重要参考指标，已被广泛认可和验证［2-7］。然而动物研究结果却显示，脾虚大鼠和正常大鼠酸刺激后sAA活性均下降，脾虚大鼠 sAA活性比值比正常大鼠显著降低［8-10］。动物实验结果与临床结果存在较大差异的原因，可能与唾液的采集方式和唾液的来源有关。临床常采用自然流出的方式获得全唾液，而动物实验以采用注射针头抽取腮腺唾液为主要方法。本研究参考课题组前期建立的人唾液采集方法［11］，采集正常大鼠和脾虚大鼠酸刺激前后的全唾液，比较两者sAA活性，对复制的脾虚大鼠模型和唾液采集方法进行评估。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠，体质量230～250 g，由广州中医药大学动物中心提供(许可证号SCXK(粤)2013-0020，质量合格证号44005900001102)。

1.2 试剂与仪器

利血平注射剂(广东邦民制药有限公司，批号121112);1%戊巴比妥钠:称取戊巴比妥钠(北京化学试剂公司，德国进口分装，批号020402，Q/H82-F158-2002)1.0 g，用蒸馏水溶解定容至100 ml，配制成1%戊巴比妥钠溶液，室温保存;柠檬酸(广东汕头市西陇化工厂，批号0601112);可溶淀粉(天津市大茂化学试剂厂);sAA活性测定试剂包括磷酸盐缓冲液、底物溶液、麦芽糖溶液、显色剂溶液均按参考文献配制［12］;高速冷冻离心机(KDC-220HR，中佳ZONKIA)。

1.3 动物分组与造模

SD大鼠饲养环境为 SPF级隔离环境(许可证号SYXK(粤)2012-0125，动物实验证号00066406)，饲养动物房温度控制在21℃，湿度58%左右。4只一笼分开饲养，自由供水与饲料。分组前对 SD大鼠48例进行酸刺激前后取样。取样后将大鼠按随机数字表法分为脾虚组和正常组各24只。脾虚组按0.4 mg·kg－1·d－1连续10 d皮下注射利血平，正常组按每只0.2 ml·d－1皮下注射生理盐水。第11天采集刺激前后的大鼠唾液样本，用以检测sAA活性。从脾虚组中随机选取大鼠10只，第11天继续注射利血平至第14天，观察利血平致大鼠衰竭情况。

1.4 柠檬酸滤纸的制作

0.4 mol/L 0.50 cm×0.50 cm的柠檬酸滤纸制作:配制预定浓度的柠檬酸溶液，待溶液稳定后倒入培养皿中，再将预定大小的滤纸放入培养皿中，浸泡10 min后取出，50℃烘干或室温晾干备用。

1.5 唾液样本的采集与保存

采样前大鼠禁食不禁水12 h，取样时间为7∶30～11∶30 am。所有大鼠称重，1%戊巴比妥钠溶液按30 mg·kg－1剂量腹腔注射麻醉，平卧固定。

1.5.1 刺激前唾液样本采集 在大鼠半麻醉状态下，用橡皮筋撑开大鼠上下颚，将移液枪伸到大鼠舌下，慢慢抽吸舌下腔内来自各唾液腺体的全唾液，采集约100 μL唾液样本并记录采样时间。

1.5.2 酸刺激后唾液样本的采集 用备好的柠檬酸滤纸刺激大鼠舌尖30 s，采集酸刺激后分泌的全唾液，间隔2.5 min后再次刺激30 s，将2次采集的唾液放于同一个 EP管中，即获得刺激后0～5 min的唾液;再用相同的方法分别获得刺激后6～10 min以及11～15 min的唾液，分别记录3个EP管内的唾液量。

1.5.3 唾液样本的保存 将采集的酸刺激前后唾液样本4℃、10000 rpm/min，离心5 min去掉黏蛋白，将上清转移至另一干净的 EP管，－20℃保存待测活性。

1.6 Bernfeld法测定大鼠唾液sAA活性

参照文献［12］方法稍加调整，取 50倍稀释的唾液样本0.5 ml加至含1 ml淀粉溶液中，37℃水浴3 min，加入 1 ml 3，5-二硝基水杨酸显色 3 min，再100℃水浴5 min后用流水冷却，加9.0 ml蒸馏水稀释。用S22可见光分光光度计(上海棱光)测定各管波长540 nm下的吸光度值，通过麦芽糖标准曲线以及各管的吸光度值，计算出各管的 sAA酶活性(U/ml)。

1.7 统计学方法

以酸刺激前后的 sAA活性计算两者的比值，sAA活性比值=酸刺激后sAA活性/酸刺激前sAA活性。采用SPSS 20.0软件进行统计分析，酸刺激前后比较采用配对 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义;组间比较采用非配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体质量情况

图1显示，皮下连续注射10 d后，脾虚组大鼠体质量明显下降，正常组大鼠体质量则平缓上升，分组前2组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P＞0.05)，10 d后脾虚组大鼠体质量显著降低(P＜0.01)。

2.2 大鼠一般情况

脾虚组大鼠在利血平注射的第2天，部分大鼠出现眼睑下垂、瞳孔缩小;第3天部分大鼠大便溏稀，胃肠道活动明显加快。连续注射11 d后，脾虚组大鼠扎堆、弓背、活动减少、双目懒睁、大便溏软、毛色不泽、食量下降，正常组大鼠毛色光泽、活动和进食均无异常。

脾虚组中随机选取10只大鼠，在连续注射利血平的第13天死亡2只，第14天死亡4只，第14天停止注射，第15天继续死亡2只，仅存活2只。死亡大鼠过度衰竭，皮肉快速腐烂。

2.3 各组刺激前后sAA活性和活性比值比较

表1显示，正常组大鼠与分组前全体大鼠酸刺激前后sAA活性组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，并呈现一致的变化趋势，即酸刺激后3个时间段的sAA活性比刺激前显著增加，而刺激后3个时间段的 sAA活性比较差异无统计学意义(P＞0.05);脾虚组大鼠刺激前 sAA与前2组比较差异无统计学意义，刺激后3个时间段的sAA活性比刺激前虽有升高趋势但无统计学意义(P＞0.05)，并比前2组显著降低(P＜0.05)。

图2显示，正常组大鼠与分组前全体大鼠刺激后3个时间段的sAA活性比值组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，并呈现一致的变化趋势，即数值都在3～4之间，且刺激后3个时间段的 sAA活性比值差异无统计学意义(P＞0.05)。然而脾虚组大鼠刺激后3个时间段的 sAA活性比值差异无统计学意义，都在1.2～1.3之间，但都显著低于前2组(P＜0.05)。

表1 各组大鼠酸刺激前后sAA活性(±s，U/ml)

表1 各组大鼠酸刺激前后sAA活性(±s，U/ml)

注:与本组刺激前比较:＊＊P＜0.01;与脾虚组同一采集时期比较:#P＜0.05，##P＜0.01

组11～15 min sAA分 组 前 全 体 大 鼠 48 34.63±4.15 73.31±7.05＊＊# 86.17±7.71＊＊## 87.26±7.72＊＊##别 鼠数 刺激前sAA 刺激后0～5 min sAA 刺激后6～10 min sAA 刺激后脾 虚 组 24 40.15±6.21 46.42±5.87 50.54±8.39 50.69±9.70正 常 组 24 27.00±3.75 70.79±8.47＊＊# 78.31±8.93＊＊# 80.12±9.81＊＊#

图2 分组前全体大鼠、脾虚组和正常组的sAA活性比值

3 讨论

利血平致脾虚模型是脾气虚证的常用造模方法。利血平属于外周交感神经阻滞药，能够耗竭动物体内的儿茶酚胺类物质，使动物出现交感神经功能低下，副交感神经功能相对亢进，引发机体代谢功能下降，如体质量减轻、腹泻、耐寒力差等［13］，动物所表现的这一系列症状和体征与中医脾气虚证患者有相似之处。本研究选择6～7周龄、体质量250 g左右大鼠，按0.4 mg·kg－1·d－1的利血平浓度皮下连续注射10 d成功复制出脾虚大鼠模型。部分文献［8-10］建议选择(300 g±20)g大鼠，但这种大鼠饲养时间超过10周，可能已经趋于老龄化，代谢速度减慢且个体差异大，会影响唾液和 sAA的分泌;对于药物浓度过低会延长成模时间［14］，过高虽然可以缩短成模时间，但会导致大鼠过早死亡［15］。本研究选择了一个适中的药物浓度，获得了较好的效果，同时也发现即使是一个适中的药物浓度，注射时间过长也会导致实验动物的大量死亡。

脾虚证患者柠檬酸刺激前后的 sAA活性比值较正常人显著下降，这一结果已被广泛认可并验证。本研究结果显示，正常组大鼠酸刺激后sAA活性显著增加，而脾虚组大鼠增加并不明显，且脾虚组大鼠刺激前后的sAA活性比值比正常组大鼠显著降低。该结果与脾虚证患者存在一致的趋势。

Ekström通过外科解剖将导管插入腮腺腺管口研究大鼠sAA对味觉刺激的反应，发现大鼠接受抗坏血酸刺激后其腮腺 sAA活性显著增加。但是本研究结果与李灿［8］、林传权等［9-10］报道的结果不一致。他们通过直接从唾液腺的开口处采集腮腺分泌唾液的方式，研究10%的醋酸刺激对大鼠唾液分泌的影响，结果显示脾虚大鼠酸刺激前后唾液sAA活性比值比正常组大鼠显著降低，而2组大鼠酸刺激后sAA活性都显著降低。对于大鼠 sAA活性对刺激物的反应存在差异的原因，可能与刺激物的种类、唾液来源、采集方式以及大鼠的周龄选择等有关。本研究参考临床脾虚证患者唾液采集方法，选择成年250 g左右大鼠采用适合大鼠舌头大小的 0.4 mol/L 0.50 cm×0.50 cm的柠檬酸滤纸，间隔2.5 min刺激大鼠舌尖30 s，以5 min作为一个时间段，采集刺激后3个时间段的全唾液标本，酸刺激前后sAA活性及其比值分析结果与临床脾虚证患者的sAA活性结果呈现一致的变化趋势。因此，本研究的唾液采集方法能够很好地反映大鼠对酸刺激的应激水平，具有简便、无损伤、结果可靠等特点，非常适合用于以sAA活性作为观测指标的脾虚模型动物的相关研究。

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Evaluation of Saliva Collection Method in Rat Model of Spleen-deficiency by Using Salivary Alpha-amylase Activity Index

LIN Jing2，LU Qun1，YANG Ze-min1△
(1.School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China; 2.Medical College of Jiaying University，Guangdong Meizhou 514031，China)

Objective To evaluate the feasibility of saliva collection method in rats with spleen-deficiency.Method Salivary samples from spleen-deficiency rats(n=24)induced by reserpine and normal rats(n=24)were collected before and after acid stimulation.Stimulated saliva of 0-5 min，6-10 min and 11-15 min were collected by putting 0.4 mol/l 0.50 ×0.50 cm of citric acid filter paper at the tongue tip 30 s every 2.5 min.Salivary alpha-amylase(sAA)activity was determined by the Bernfeld method，and sAA activity ratio was calculated.Result:Spleen-deficiency rats collapsed severely and their weight showed significantly lower than the normal rats.The sAA activity and sAA activity ratios had no significant difference between normal rats and all rats before be grouped.There was no significant difference in unstimulated sAA activity between spleen-deficiency and normal rats，while spleen-deficiency rats had lower sAA activity and sAA activity ratio in stimulated saliva of three time periods than normal rats.Conclusion Saliva collection method established by the present study，by which sAA activity and sAA activity ratio in rat showed similar trend with that of human，could be used in the research of spleen-deficiency rats related with sAA.

Salivary alpha-amylase;Acid stimulation;Spleen-deficiency rats;Saliva collection

R285.5

:B

:1006-3250(2016)07-0909-03

2015-11-21

国家自然科学基金资助项目(81102703)-基于AMY1基因拷贝数变异、N-糖基化和β-肾上腺素能受体介导的脾虚证唾液淀粉酶活性改变机制的研究;广东省科技计划项目(2013A032500005)-脾-物质代谢关联”新假说的miRNA物质基础及“从脾论治“代谢性疾病的分子机制研究”;广东药学院科技处-附属第一 医 院 联 合 自 然 科 学 培 育 基 金 项 目 (GYFYLH201303，GYFLH201313)

林 静(1989-)，女，广东人，医学硕士，从事生物化学和分子生物学的研究。

△通讯作者:杨泽民(1979-)，男，湖南人，高级实验师，医学博士，从事中西医结合疾病机制研究，Tel:020-39352192，E-mail:yzm310200@gmail.com。