胡华刚，陶 黎，吴佳莹，赵宏艳，肖 璇，李岳泽，刘梅洁，汪文来，徐斯凡，潘静华，何 坚，鞠大宏△

(1.中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700;2.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;3.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193;4.中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081;5.福建中医药大学康复医学院，福州 350108)

藏药二十五味驴血丸对痹症(类风湿关节炎)大鼠的治疗作用及其机理探讨

胡华刚1，2，陶 黎2，吴佳莹2，赵宏艳2，肖 璇3，李岳泽2，刘梅洁2，汪文来2，徐斯凡4，潘静华2，何 坚5△，鞠大宏1，2△

(1.中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700;2.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;3.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193;4.中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081;5.福建中医药大学康复医学院，福州 350108)

目的:探讨藏药二十五味驴血丸对胶原诱导性关节炎大鼠的治疗作用及其机制。方法:选用雌性SD大鼠60只，按随机数字表法分为空白对照组和造模组，再将造模成功的大鼠随机分为CIA模型组、甲氨蝶呤组、二十五味驴血丸低、中、高剂量组，连续给药4周。结果:与模型组比较，二十五味驴血丸使CIA大鼠的AI评分和肿胀肢体的脚掌厚度显著降低，并可使CIA大鼠血清中IL-17A的含量显著降低，使TGF-β1含量显著升高。结论:二十五味驴血丸对胶原诱导的大鼠关节炎具有显著的治疗效果，其可能通过调控Th17/Treg细胞平衡从而达到治疗类风湿关节炎的作用。

二十五味驴血丸;干黄水;类风湿关节炎;Th17/Treg平衡

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征且逐渐导致软骨及骨关节进行性破坏和不可逆性残疾的自身免疫性疾病，并伴有并发症，极大地影响了患者的生命质量［1］。

藏医对类风湿关节炎有系统而深入的认识，《四部医典》就将该类疾病单列成章节加以详细论述。二十五味驴血丸(，藏文名:珍才尼埃日布)是具有国家批准文号的藏医经典方剂，始载于《四部医典》，是藏医用于治疗RA的主要药物［2］。虽然二十五味驴血丸具有显著的临床疗效［3-5］，但目前尚未见到有关其作用机制方面的研究报道。本文以II型胶原诱导的关节炎(collageninduced arthritis，CIA)大鼠作为RA模型，研究二十五味驴血丸对类风湿关节炎的治疗作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用6周龄SPF级SD雄性大鼠60只，由军事医学科学院实验动物中心提供(动物许可证号SCXK(军)2012-0004)，饲养于中央民族大学动物实验室。

1.1.2 主要试剂与仪器 主要试剂:牛II型胶原(货号20022，批号150394);不完全弗氏佐剂(货号7002，批号150057);美国 Chondrex公司产品;戊巴比妥钠(批号P3761);Sigma公司;大鼠白细胞介素(IL)-17A ELISA试剂盒(货号BMS635，批号118323013);美国affymetrix公司;大鼠转化生长因子(TGF)-β1ELISA试剂盒(货号CSB-E04727r，批号T02039922);武汉华美生物工程有限公司;二十五味驴血丸(批号1506114);青海省格拉丹东药业有限公司;甲氨蝶呤(批号150701);通化茂祥制药有限公司。主要仪器:粉碎机，北京中西远大科技有限公司;单反相机，日本佳能公司;200目钢筛，上虞市建化仪器厂;数显游标卡尺，上海工具厂有限公司;Multiskan Mk3酶标仪、Well wash 4 Mk2洗板机，美国Thermo公司;K15离心机，德国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理［6］适应性喂养1周后随机选取8只作为空白对照组，其余的大鼠用尾根部皮下注射II型胶原与不完全弗氏佐剂混合物的方法诱导出类风湿关节炎大鼠模型(CIA模型)，空白对照组不做任何处理。

第2次免疫7 d后，根据关节炎指数(arthritis index，AI)评分标准对关节炎的严重程度进行0～4级别评分。将单个肢体AI评分大于2分的大鼠按随机数字表法分为CIA模型组、阳性药组、二十五味驴血丸低、中、高剂量组各8只。

将二十五味驴血丸粉碎后过200目筛，制成混悬液。按照《药理实验方法学》第四版中的换算公式，将人的剂量换算成大鼠的剂量。二十五味驴血丸低、中、高剂量分别是150、300、600 mg/kg，每天灌胃1次，连续4周。阳性药为甲氨蝶呤(3 mg/(kg ·week))，空白对照组和模型组给等体积双蒸水。

1.2.2 取材 给药4周后戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，2500 r/min离心，20 min后取血清，分装后－80℃保存。

1.2.3 指标的检测 ①给药后每隔3 d进行AI评分［7］。0分:正常;1分:1个或多个趾关节红或红肿;2分:踝关节以下中度红肿;3分:包括膝关节在内的严重红肿;4分:包括膝关节在内的完全红肿，关节变形、残废;②给药后每隔6 d用数显游标卡尺测量各组大鼠肿胀肢体脚掌厚度的同时测量大鼠体质量;③按试剂盒说明测定血清 IL-17A和TGF-β1含量。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，以均数±标准差(±s)表示，若数据为正态分布时釆用单因素方差分析，方差齐性时组间两两比较，采用LSD检验;若方差不齐则用其项下Tamhane’s T2(M)进行检测;若数据为非正态分布时，采用非参数检验Kruskal-Wallis单因素ANOVA(k样本)(W)，组间两两比较采用Stepwise step-down检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二十五味驴血丸对CIA大鼠AI评分影响

表1图1显示，与CIA模型组比较，给药第4天，二十五味驴血丸高剂量组大鼠的AI评分显著降低(P＜0.05);给药8 d后，二十五味驴血丸使类风湿关节炎大鼠的AI评分显著降低(P＜0.01)，甲氨蝶呤组和二十五味驴血丸给药组之间比较差异无统计学意义。

表1 二十五味驴血丸对CIA大鼠AI评分的影响(±s)

表1 二十五味驴血丸对CIA大鼠AI评分的影响(±s)

注:与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 鼠数 给药前 给药4 d 给药8 d 给药12 d 给药16 d 给药20 d 给药24 d 给药28 d空白对照组80 0 0 0 0 0 0 0模 型 组 8 3.67±0.35 3.61±0.24 3.54±0.39 3.40±0.39 3.30±0.26 3.25±0.35 3.08±0.49 3.00±0.33甲氨蝶呤组 8 3.64±0.38 3.14±0.38 2.69±0.37＊＊2.38±0.23＊＊2.25±0.27＊＊2.21±0.39＊＊2.05±0.28＊＊2.00±0.32＊＊低剂 量 组 8 3.65±0.34 3.45±0.37 3.00±0.27＊＊2.59±0.20＊＊2.50±0.27＊＊2.44±0.32＊＊2.33±0.25＊＊2.21±0.27＊＊中剂 量 组 8 3.63±0.35 3.32±0.41 2.83±0.35＊＊2.50±0.33＊＊2.39±0.33＊＊2.33±0.35＊＊2.14±0.24＊＊2.11±0.22＊＊高剂 量 组 8 3.69±0.26 3.07±0.19* 2.81±0.26＊＊2.42±0.20＊＊2.33±0.26＊＊2.25±0.27＊＊2.11±0.29＊＊2.04±0.27＊＊

2.2 二十五味驴血丸对CIA大鼠肿胀肢体脚掌厚度的影响

表2显示，与空白对照组比较，模型组大鼠肿胀肢体的脚掌厚度显著增加(P＜0.01)。给药2周后与模型组比较，二十五味驴血丸可使CIA大鼠肿胀肢体的脚掌厚度显著降低(P＜0.01)，甲氨蝶呤组和二十五味驴血丸给药组之间比较差异无统计学意义。给药3周后，二十五味驴血丸低、中、高剂量组大鼠肿胀肢体的脚掌厚度与空白对照组比较差异无统计学意义。

2.3 二十五味驴血丸对CIA大鼠体质量的影响

表3显示，与空白对照组比较，CIA大鼠的体质量均显著降低。给药4周后，甲氨蝶呤组大鼠体质量显著高于模型组大鼠(P＜0.05)，二十五味驴血丸的中、高剂量组大鼠体质量显著高于模型组(P＜0.01)，二十五味驴血丸给药组和阳性药组比较差异无统计学意义。

表2 二十五味驴血丸对CIA大鼠肿胀肢体脚掌厚度的影响(±s)

表2 二十五味驴血丸对CIA大鼠肿胀肢体脚掌厚度的影响(±s)

注:与空白对照组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 鼠数 给药前 给药1周 给药2周 给药3周 给药4周空 白 对 照 组 8 6.09±0.86 6.53±0.59 6.64±0.43 6.79±0.48 6.86±0.54模 型 组 8 8.49±1.10## 9.31±1.40## 9.23±0.86## 8.89±1.12## 8.41±0.71##甲 氨 蝶 呤 组 8 8.41±1.06## 8.56±1.01## 7.50±0.53#＊＊ 7.32±0.79＊＊ 7.11±0.36＊＊低 剂 量 组 8 8.32±0.68## 9.06±1.09## 8.19±0.52##＊＊ 7.39±0.42＊＊ 7.20±0.42＊＊中 剂 量 组 8 8.57±0.72## 8.67±0.49## 7.80±0.34##＊＊ 7.28±0.40＊＊ 7.12±0.77＊＊高 剂 量 组 8 8.32±0.66## 8.58±1.07## 7.66±0.64##＊＊ 7.21±0.64＊＊ 7.07±0.53＊＊

表3 二十五味驴血丸对大鼠体质量的影响(±s)

表3 二十五味驴血丸对大鼠体质量的影响(±s)

注:与空白对照组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 例数 给药前 给药1周 给药2周 给药3周 给药4周空 白 对 照 组 8 335.82±12.87 374.81±20.13 425.33±18.48 447.10±15.37 462.55±21.17模 型 组 8 283.21±14.48## 307.74±14.64## 331.06±13.31## 363.89±14.01## 363.82± 9.58##甲 氨 蝶 呤 组 8 283.88±29.18## 311.01±39.74## 353.26±25.20## 377.99±16.00## 387.78±12.51##*低 剂 量 组 8 284.81±25.28## 306.09±31.66## 349.54±23.87## 375.47±22.55## 383.48±18.17##中 剂 量 组 8 283.18±19.62## 310.24±17.96## 355.16±14.30## 380.46±10.43## 394.31± 8.84##＊＊高 剂 量 组 8 283.88±23.50## 313.02±22.22## 360.85±19.83## 381.38±18.51## 401.32±15.49##＊＊

图1 末次给药前各组大鼠AI评分观察

2.4 二十五味驴血丸对CIA大鼠血清中IL-17A和TGF-β1水平的影响

表4显示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清中IL-17A水平显著升高，TGF-β1水平显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，二十五味驴血丸可使CIA大鼠血清中IL-17A含量显著降低的同时，血清中TGF-β1的含量显著升高(P＜0.05)。

表4 二十五味驴血丸对CIA大鼠血清中IL-17A和TGF-β1水平的影响(±s)

表4 二十五味驴血丸对CIA大鼠血清中IL-17A和TGF-β1水平的影响(±s)

注:与空白对照组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 例数 IL-17A的含量(pg/ml) TGF-β1的含量(ng/ml)空白对照组8 0.52±0.04 34.15±2.88模 型 组 8 1.09±0.11## 27.96±3.69##甲氨蝶呤组 8 0.58±0.11＊＊ 35.91±3.99*低 剂 量 组 8 0.65±0.09* 37.11±3.34*中 剂 量 组 8 0.58±0.09＊＊ 37.45±3.65＊＊高 剂 量 组 8 0.52±0.07＊＊ 37.52±3.41＊＊

3 讨论

RA属于藏医“真布”病，是藏医临床常见病［3］。藏医认为［8-10］，若人久居或劳作于寒湿之地，长期过量进食油脂之物，或精神压抑或生活不规律等因素，导致人体三大因素(龙、赤巴、培根)失衡，进而使精华不化、清浊不分，饮食精微未在本位成熟而变成“黄水”，致使“黄水”激增。“黄水”扩散至骨关节、肌肉和筋络后腐蚀关节、肌肉、骨骼和筋脉，从而导致RA的发生。藏医对RA的治疗以“干黄水”为主，同时调节“三大因素”的平衡［8］。“干涸黄水”是藏医治疗RA的方法论，而二十五味驴血丸是藏医“干黄水”用于治疗RA的主要药物。CIA大鼠模型是经典的评价实验药物抗炎和免疫抑制作用的动物模型［11］。本实验研究结果表明，二十五味驴血丸不但对类风湿关节炎大鼠具有显著的治疗作用，还能增加CIA大鼠的饮食，这与藏医临床研究的结果相符。

现代医学研究表明，Th17/Treg细胞失衡在RA的发病机制中扮演着非常重要的角色［12-14］。Th17细胞是近年发现的一类新型CD4+T细胞亚群，能特异性高水平地分泌白细胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)。IL-17A可刺激滑膜细胞表达IL-6/ IL-8，这些因子能募集中性粒细胞、未成熟的树突状细胞、T细胞在关节滑液中聚集，扩大炎症反应［15-16］，还可刺激滑膜细胞分泌多种血管因子促进血管翳的形成［17］。IL-17A作用于骨髓基质细胞，使其大量表达核因子κB受体活化因子配体(RANKL )，RANKL与破骨细胞的前体细胞和破骨细胞表面受体结合，促进破骨细胞的分化、成熟，加快骨吸收［18］。Treg细胞是具有免疫抑制作用、维持免疫耐受自然发生的专职免疫调节细胞，能控制免疫应答强度，减轻对机体组织损伤［19］。Treg细胞分泌的转化生长因子-β1(TGF-β1)在诱导初始T细胞分化为成熟Treg细胞的同时，还能抑制免疫效应细胞的增殖和分化，抑制细胞因子的产生及其免疫调节作用［20］。

CIA大鼠体内存在Th17/Treg细胞分化失衡，Th17细胞数量显著大于Treg细胞的数量［21］。本实验研究发现，二十五味驴血丸和甲氨蝶呤皆可使CIA大鼠血清中IL-17A的含量显著降低，TGF-β1的含量显著升高。孙梦怡等［22］研究发现，甲氨蝶呤可以有效降低小鼠关节炎的发病率及平均关节炎指数。流式细胞术检测显示，甲氨蝶呤组Th17细胞比例显著降低，Treg细胞比例显著增加。本实验研究结果与此具有一致性，表明二十五味驴血丸可能通过调节Th17/Treg细胞的平衡从而达到治疗类风湿关节炎的作用，但二十五味驴血丸治疗类风湿关节炎的具体机制尚需进一步研究。

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Discussion of Treating Effects and Its Mechanism of Tibetan Medicine Twenty-five Flavor Lvxue Pills to Bi Syndrome(Rheumatoid Arthritis)

HU Hua-gang1，2，TAO Li2，WU Jia-ying2，ZHAO Hong-yan2，XIAO Xuan3，LI Yue-ze2，LIU Mei-jie2，WANG Wen-lai2，XU Si-fan4，PAN Jing-hua2，HE Jian5△，JU Da-hong1，2△
(1.Postdoctoral Research Station，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2.Institute of Basic Theory for Chinese medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;3.The Institute of Medicinal Plant Development，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 10193，China; 4.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Minzu University of China，Beijing 100081，China;5.Fuzhou of Fujian University of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation Medicine，350108，China)

Objective:To explore the therapeutic effect and mechanism of tibetan compound prescription of Ershiwuwei lvxue pills on Collagen-Induced Arthritis(CIA)rats.Method:Eight rats were randomly selected as blank control group from sixty SD female rats which were six weeks old，and other rats as Rheumatoid arthritis model group.The successful model rats were randomly devided into CIA group，positive drug(MTX)group，low dose ershiwuwei lvxue pills group，medium dose ershiwuwei lvxue pills group and high dose ershiwuwei lvxue pills group.Every group was eight rats.The blank control group and the CIA model group were fed with equal volume of double distilled water for four weeks.The contents of IL-17A and TGF-β1 in serum were measured by ELISA after the rats were killed.Result:Compared with CIA group，the AI scores and paw thickness of the Ershiwuwei lvxue pills groups obviously decreased.Compared with CIA group，the level of IL-17A in serum of ershiwuwei lvxue pills groups decreased obviously while the level of TGF-β1 increased evidently.Conclusion:Ershiwuwei lvxue pills has a obviously therapeutic effect on CIA rats and may play the role of the treatment of RA through regulating the balance of Th17/Treg cells.

ershiwuwei lvxue pills;Dry yellow water;Rheumatoid Arthritis;Th17/Treg balance

R593.22

:B

:1006-3250(2016)08-1053-04

2015-12-16

胡华刚(1983-)，男，山东济宁人，医学博士后，从事传统医药治疗痹症的基础研究。

△通讯作者:何 坚，男，副教授，从事骨关节疾病的中医康复研究，Tel:18960818819;鞠大宏(1963-)，男，辽宁凤城人，研究员，医学博士，从事中医防治痹症(类风湿关节炎和骨质疏松症)的临床与基础研究，Tel:010-64089025，E-mail: judahong@sohu.com。