毕　蕾, 颜晓静, 杨　烨, 陈卫平

(南京中医药大学基础医学院 , 江苏 南京　210023)



川芎嗪对肝癌HepG2细胞迁移、侵袭和细胞骨架的影响

毕蕾, 颜晓静, 杨烨, 陈卫平

(南京中医药大学基础医学院 , 江苏 南京210023)

中国图书分类号：R284.1；R329.24；R73-37；R735.702.2

摘要:目的通过研究川芎嗪(tetramethypyrazine, TMP)对肝癌HepG2细胞迁移能力、侵袭能力和细胞骨架的影响,探讨TMP抑制肝癌细胞侵袭转移的作用及机制。方法以肝癌HepG2细胞为靶细胞,通过细胞迁移划痕实验观察不同浓度的TMP对肝癌HepG2细胞迁移的影响及其时效关系；采用细胞侵袭实验，检测TMP对HepG2细胞侵袭能力的影响；应用高内涵细胞分析系统(HCS)免疫荧光法检测TMP对HepG2细胞骨架的影响。结果TMP对HepG2细胞的迁移能力有抑制作用，并呈现时间和剂量依赖性；TMP能够明显抑制HepG2细胞的侵袭(P<0.01)，并呈现一定的时间依赖性；TMP可减少HepG2细胞微丝数量，降低细胞骨架的面积，差异有显著性(P<0.01)，有剂量相关性。结论TMP能抑制肝癌HepG2细胞迁移及侵袭，具有潜在的抗肿瘤转移作用，其机制可能与TMP能明显降低细胞骨架微丝数量和面积，抑制骨架微丝重排相关。

关键词：川芎嗪；肝癌；HepG2； 细胞迁移；细胞侵袭；细胞骨架

川芎始载于东汉时期的《神农本草经》，是临床常用活血理气类中药，能够袪风止痛、活血，前人誉其为“血中气药”，临床多用于瘀血阻滞等病症。川芎嗪(tetramethypyrazine, TMP)是有效单体，分子式为C8H12N2，化学名为四甲基吡嗪，首先从川芎的生物碱中分离得到。TMP目前在临床上广泛应用,不仅用于心血管疾病、呼吸系统、消化系统、泌尿系统及代谢性疾病的治疗,其抗肿瘤作用也日益受到关注[1-4]。在前期研究中，我们发现TMP对肝癌HepG2细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肺癌A549细胞的增殖均有抑制作用，通过进一步研究发现TMP对肝癌HepG2细胞具有诱导凋亡及调控相关蛋白表达的作用[5]，但其对肿瘤转移的作用尚未明确。结合前期研究结果，本文研究对象为肝癌HepG2细胞，通过观察TMP对肝癌HepG2细胞迁移能力、细胞侵袭和细胞骨架的影响，探讨TMP抗肝癌细胞侵袭转移的作用及机制，为临床肿瘤综合治疗中川芎嗪的合理应用提供参考。

1材料

1.1药物与试剂川芎嗪(中国药品生物制品检定所标准品，批号110817-200305)；紫杉醇注射液(PTX)(太阳集团四川太极制药有限公司，批号12100031)；DMEM(Gibco，批号：11995-065)；澳洲进口胎牛血清(Gibco，批号：16000-044)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，批号：25200-056)；青-链霉素(Gibco，批号：15140-122)；细胞迁移试剂盒Cellomics Cell Motility kit(Thermo Scientific，美国，批号：OE187113)；细胞骨架分析试剂盒Cellomics Cytoskeletal Rearrangement kit(Thermo Scientific，美国，批号：OA183099)；罗丹明染色剂(Thermo Scientific，美国，批号：OB16636440)；罗丹明-鬼笔环肽染色剂(Thermo Scientific，美国，批号：OC183818)；基质胶Matrigel matrix(BD公司，美国，批号：2342761)；4%多聚甲醛(Sigma公司，美国，批号：20120421)；甲醇(Kermel公司，中国，批号：20140410)。

1.2细胞系及细胞培养肝癌HepG2细胞株，购于中国科学院上海细胞库。HepG2细胞培养所用培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养贴壁，传代周期为2~3 d，取对数生长期细胞进行实验。

1.3主要仪器高内涵细胞分析系统(型号：Arrayscan VTI 700，Thermo Scientific，美国)；RTCA DP实时无标记细胞传感电阻仪 (型号：RTCA DP，Roche公司，瑞士)；超净工作台(型号：SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司，中国)；CO2恒温培养箱(型号：NU4950E， NUAIRE公司，美国)；倒置相差显微镜(型号：DFC-259 Leica，德国)。

2方法

结合前期研究基础，选用肝癌HepG2细胞为研究对象，依据前期实验获得TMP对HepG2细胞的IC50确定剂量[5]，进行以下实验。

2.1细胞划痕实验检测细胞迁移取培养至对数期的HepG2细胞，用0.25%胰酶消化，用滴管吹打至单细胞悬液，调整细胞密度为1×108·L-1，接种于6孔板上，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下，细胞培养箱中培养24 h至细胞基本融合。用100 μL微量移液头在6孔板内垂直划痕，PBS液冲洗2次后加入TMP溶液，每孔1 mL，使终浓度分别为50、100和200 mg·L-1，阴性对照组加入等体积的细胞培养液。将培养板置入37℃、5% CO2培养箱中培养12、24、48 h，分别用倒置相差显微镜观察。每个视野内，随机选择3个区域，并计算100×视野内迁移划痕空隙的长度。

2.2细胞侵袭实验在CIM-plate细胞迁移浸润检测板上室中加入一层Matrigel凝胶，下室加入趋化因子600 μL。然后在上室中加入细胞悬液，调整细胞密度为1×108·L-1，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下，细胞培养箱中培养24 h。设给药组和阴性对照组，每组3个复孔，在细胞传感电阻仪动态检测72 h。

2.3高内涵细胞分析系统免疫荧光法检测细胞骨架将细胞消化悬浮于培养液中，吹打接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下细胞培养箱中培养24 h后给药，分阴性对照组、给药组以及阳性对照组。阴性对照组加入等体积的细胞培养液，给药组加入TMP溶液，每孔50 μL，阳性对照组加紫杉醇，终浓度均为10 mg·L-1，每组设3个复孔。培养48 h，弃去细胞培养上清，加入提前预热的多聚甲醛固定，每孔200 μL，室温孵育30 min；去除固定液，清洗2次；加入穿透液，室温孵育15 min；去除穿透液，加入封闭液，进行封闭，室温孵育15 min；去除封闭液，加入抗体探针溶液，室温孵育1 h；去除探针溶液，清洗3次，避光室温孵育15 min；去除Whole cell stain 溶液，清洗3次；封口96孔板，于HCS 读板，4℃保存。

3结果

3.1TMP对肝癌HepG2细胞迁移能力的影响细胞划痕实验中，TMP对肝癌细胞迁移的影响如Fig 1所示，随机选择视野内3个区域，并计算100×视野内迁移划痕空隙的长度，结果如Fig 2所示，TMP能够明显抑制肝癌HepG2细胞迁移，并呈时间依赖性和剂量依赖性。

3.2TMP对肝癌HepG2细胞侵袭的影响实时细胞分析系统(RTCA DP)检测TMP对HepG2细胞侵袭结果如Fig 3示，与阴性对照组比较，TMP能够明显抑制HepG2细胞的侵袭，并呈现一定的时间依赖性。TMP对HepG2细胞分别作用24 h、48 h和72 h的细胞侵袭分析结果如Fig 4、Tab 1所示，与对照组比较，TMP作用48 h和72 h后对细胞侵袭均能明显抑制(P<0.01)，呈现一定的时间依赖性。

Tab 1　Effect of TMP on invasion of HepG2 cells

***P<0.01vscontrol

3.3TMP对肝癌HepG2细胞骨架的影响高内涵细胞分析系统免疫荧光法检测TMP对肝癌HepG2细胞骨架蛋白-肌动蛋白F-actin的结果如Fig 5示，对照组细胞骨架蛋白-肌动蛋白F-actin构成的微丝面积比较大，TMP作用后，HepG2细胞中由F-actin 构成的微丝减少。骨架面积分析结果见Fig 6、Tab 2，结果表明TMP能够明显降低人肝癌细胞HepG2骨架的面积(P<0.01)，且呈一定的剂量相关性。

Tab 2　Effect of TMP on cytoskeleton of HepG2 ±s，n=3)

***P<0.01vscontrol

4讨论

肿瘤细胞的侵袭转移是恶性肿瘤的主要生物学特性之一，是恶性肿瘤的发生和发展过程中的危险阶段，其预后不良，是肿瘤患者死亡的主要原因，据统计，临床肿瘤患者约有80%~90%死于肿瘤细胞的侵袭和转移。细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)是肿瘤细胞侵袭转移的基础和必备条件，是一个动态的、多步骤的过程。细胞间黏附性的丧失、肿瘤基底膜和细胞外基质的破坏以及细胞骨架的重建，导致细胞运动性增加和细胞迁移的产生[6-9]。

Fig 1　Effect of TMP on migration of HepG2 cells(×100)

Fig 2　Effect of TMP on scratch length of HepG2 cells(n=3)

***P<0.01vscontrol group

Fig 3　Effect of TMP on invasion of HepG2 cells

细胞骨架为经由蛋白纤维交织而成的立体网架结构，充满整个细胞质，为了保持细胞特有的形状，其与外侧的细胞膜和内侧的核膜存在一定的结构联系，并与细胞运动有关[10]。微管、微丝和中间纤维是组成细胞骨架主要结构，而微丝在多种肿瘤细胞中被大量修饰，与肿瘤细胞异常的生长特点如黏附和转移有关。肌动蛋白F-actin是构成微丝的主要细胞骨架蛋白，在肿瘤细胞形态改变和迁移中起着非常重要的作用[11-12]。

Fig 4　Effect of TMP on invasion of HepG2 cells after

***P<0.01vscontrol group

Fig 5　Fluorography of HepG2 cells

Fig 6　Effect of TMP on HepG2 cell

***P<0.01vscontrol group

课题组通过研究发现TMP对HepG2细胞迁移有抑制作用，并呈现时间依赖性和剂量依赖性；TMP能够明显抑制HepG2细胞的侵袭，并呈现一定的时间依赖性；与空白对照组及阳性对照组比较，TMP能够明显降低人肝癌HepG2细胞微丝数量和细胞骨架的面积，且呈剂量相关性，这可能是因为TMP通过调节细胞松弛素，阻止肌动蛋白聚合成微丝，从而减少微丝的形成，影响微丝的功能。总之，TMP可抑制肝癌HepG2细胞的迁移及侵袭，具有潜在的抗肿瘤转移作用，其作用机制可能与TMP能明显减少细胞骨架微丝数量和降低细胞骨架面积，抑制骨架微丝重排相关。由此TMP是否可以抑制细胞获得新的间质表型，进而抑制细胞发生EMT，有待于进一步研究。

(致谢:本文实验在南京中医药大学校级重点实验室中药性效研究实验室完成，感谢实验室对本项目实验的鼎力支持！)

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Effect of tetramethypyrazine on cell migration, cell invasion and cytoskeleton in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2

BI Lei, YAN Xiao-jing , YANG Ye, CHEN Wei-ping

(DeptofPreclinicalMedicine,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Abstract:AimTo explore the mechanism of tetramethypyrazine (TMP) in the inhibition of cancer cell invasion and metastasis, by investigating the effect of TMP on cell migration, cell invasion and cytoskeleton of HepG2 cells. MethodsUsing HepG2 cells as target cells, cell migration of different concentrations of TMP on HepG2 cells was assayed by the scratch wound healing assay. Matrigel cell invasion assay was used to detect the effect of TMP on the invasion of HepG2 cells. The effect of TMP on cytoskeleton of HepG2 cells was detected by high content screening (HCS).ResultsTMP inhibited the migration of HepG2 cells, and showed a time-dependent and dose-dependent manner. Moreover, TMP significantly inhibited the invasion of HepG2 cells (P<0.01), and showed a certain time-dependence. Furthermore, compared with control group, a significant decrease in HepG2 cytoskeleton area was found in a dose-dependent manner (P<0.01). ConclusionTMP can inhibit the migration and invasion of HepG2 cells, and it has the potential to resist tumor metastasis, and the mechanism may be associated with TMP significantly decreasing the number and area of cytoskeleton, and inhibiting the rearrangement of cytoskeleton.

Key words:tetramethypyrazine; liver cancer;HepG2;cell migration; cell invasion; cytoskeleton

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)02-0194-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.010

作者简介:毕蕾(1984-),女,博士,讲师,主治医师,研究方向：中医药抗肿瘤, Tel:025-85811941，E-mail:bellajssz@163.com；陈卫平(1959-),女,博士,教授,博士生导师， 研究方向：中医药抗肿瘤，通讯作者，Tel/Fax: 025-85811923，E-mail: wp2002123@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81273638, 81503486);江苏省高校自然科学研究项目(No 14KJD360004); 江苏省中医药局科技重点项目(No ZD201502);江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(No KYLX15_0997)

收稿日期：2015-11-24，修回日期：2015-12-16

网络出版时间：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.020.html网络出版地址：2016-1-25 15:57