韩　翰,王　敏

(沈阳医学院1.生物化学教研室、2.病原生物学教研室， 辽宁 沈阳　110034)



SAHA和TRAIL联合使用对乳腺癌雌激素受体阳性细胞MCF-7生长的影响

韩翰1,王敏2

(沈阳医学院1.生物化学教研室、2.病原生物学教研室， 辽宁 沈阳110034)

中国图书分类号：R329.24；R392.11；R737.9；R916.4；R979.1

摘要:目的实时观测SAHA和TRAIL联合使用后对乳腺癌雌激素受体阳性细胞MCF-7生长的影响。方法实时无标记动态细胞分析系统(real time cell analysis, RTCA)动态监测各种处理因素对乳腺癌MCF-7细胞生长状况的影响，并通过BiostationIM活细胞工作站实时收集各种处理因素对乳腺癌MCF-7细胞增殖干预的形态学证据。结果xCELLigence RTCA实时无标记动态细胞分析系统显示，随着TRAIL的加入，SAHA对MCF-7细胞的抑制作用明显增强。SAHA和TRAIL的联合用药可能提高了SAHA对MCF-7细胞的敏感性。实时活细胞工作站成像实验进一步证明SAHA和TRAIL联合用药对MCF-7乳腺癌细胞的抑制作用强于SAHA或TRAIL单独用药。结论SAHA和TRAIL的联合使用对MCF-7细胞的生长具有协同抑制作用。

关键词:SAHA；TRAIL；乳腺癌；雌激素受体阳性；MCF-7；协同作用

乳腺癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一，近年来发病率已居全球女性恶性肿瘤首位[1-2]。乳腺作为一个激素反应器官，机体内分泌系统的变化与乳腺发育和癌变的发生密切相关[3]。据临床统计，乳腺癌患者中70%~80%为雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性乳腺癌[4]，因此针对雌激素受体阳性乳腺癌的研究成为探究乳腺癌发生、发展原因的重要内容。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)通过阻滞细胞周期进程、诱导细胞凋亡与自噬的产生，具有较强的抗肿瘤活性[5]，与其它药物联合应用展现了良好的应用前景[6]。SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)是第二代氧肟酸类组蛋白去乙酰化酶抑制药，它通过抑制HDAC活性，诱导靶细胞中组蛋白高度乙酰化，启动某些特异性基因的表达而达到阻断肿瘤生长的目的[7-8]。但也有大量研究证明SAHA浓度过高时对细胞具有较大的毒副作用，同时SAHA还存在体内半衰期短、易代谢、长期使用会产生耐药等缺点。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是1995年Wiley等[9]发现的一种凋亡分子，为Ⅱ型膜蛋白，属于TNF家族。TRAIL可通过与死亡受体(death receptor, DR)DR4和DR5结合，特异性诱导肿瘤细胞凋亡，由于正常细胞不表达或很少表达死亡受体DR4和DR5，因此TRAIL对正常细胞的杀伤作用很小[10-12]。本文将SAHA和TRAIL联合作用于乳腺癌雌激素受体阳性细胞系MCF-7，实时观测SAHA和TRAIL联合使用后对MCF-7细胞生长状态的影响，为雌激素受体阳性乳腺癌的药物联合治疗提供一个新的思路。

1材料与方法

1.1材料人乳腺癌细胞株MCF-7购自美国ATCC细胞库；RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素以及链霉素购自美国Thermo公司；SAHA购自美国Sigma-Aldrich公司；人重组TRAIL蛋白购自美国Peprotech公司；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒购自美国Promega公司；Annexin-V-FLUOS staining kit试剂盒购自美国Roche公司；其他的化学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养人乳腺癌细胞系MCF-7培养于含15%胎牛血清、1×108U·L-1的青霉素、100 mg·L-1链霉素的RPMI 1640 培养基中。

1.2.2实时细胞增殖检测将1×107·L-1乳腺癌MCF-7细胞接种于xCELLigence实时无标记动态细胞分析系统的E-Plate 96板(Roche)各孔中，待细胞进行无血清同步化处理后，各孔分别加入SAHA(0、 0.5、1、2、5、10、20、50 μmol·L-1)以及TRAIL(0、 5、10、20、30、40、50、100 μg·L-1)进行孵育，以DMSO为对照组。通过xCELLigence系统中各孔微电阻量的变化，动态监测0~72 h范围内MCF-7细胞的生长情况，实验重复3次。

1.2.3利用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒验证RTCA实时分析系统的检测结果将1×107·L-1乳腺癌MCF-7细胞接种于96孔板各孔中，细胞进行无血清同步化处理24 h后，按“1.2.2”方法加入SAHA和TRAIL共同孵育，细胞分别培养24、48 h后进行MTT测定，了解MCF-7细胞增殖的情况。

1.2.4实时活细胞成像将5×108·L-1乳腺癌MCF-7细胞接种于BioStationIM活细胞工作站μ-Slide 4 Well(Nikon)各孔中，待细胞进行无血清同步化处理后，加入SAHA和TRAIL共同孵育48 h。设定BioStationIM活细胞工作站以相差模式、总拍摄时长48 h、间隔12 h示踪μ-Slide 各孔中乳腺癌MCF-7细胞生长状况，实时收集各种处理因素对乳腺癌细胞增殖干扰的形态学证据。

1.2.5细胞凋亡荧光检测将5×108·L-1乳腺癌MCF-7细胞接种于12孔板各孔中，同步化处理后，加入SAHA和TRAIL与MCF-7细胞分别孵育0、4、12、24、36、48 h。将孵育后的细胞分别加入100 μL Annexin-V-FLUOS荧光染液，室温静置15 min后，应用Leica DMI6000B显微镜进行荧光观察。

2结果

2.1SAHA对乳腺癌细胞增殖影响的实时测定将乳腺癌MCF-7细胞接种于96孔板中，分别与0~50 μmol·L-1SAHA共同孵育，通过xCELLigence RTCA分析系统中细胞指数(cell index, CI)曲线的变化，实时观测SAHA对乳腺癌细胞生长状态的影响。从Fig 1A可以看出，未加入SAHA的细胞，随着时间的延长，其细胞指数曲线不断上升，生长状况良好，48 h即到达增殖平台期；而经SAHA处理的MCF-7细胞增殖均呈现时间、剂量依赖性抑制。低浓度SAHA(0.5 ~1.0 μmol·L-1)作用效果不明显，细胞指数曲线维持稳定，细胞生长状况未受太大影响，48 h后也到达生长平台期。当SAHA浓度达到2.0 μmol·L-1以上时，随着处理时间的延长、SAHA浓度的增加，乳腺癌细胞不再增殖，细胞指数曲线下降，细胞生长被抑制。其中，高浓度SAHA(20~50 μmol·L-1)作用效果明显，孵育24 h就显现较明显的抑制效果，而当SAHA作用时间达到48 h时，系统显示此时半抑制浓度(50% inhibiting concentration, IC50)为5.0 μmol·L-1。

同时，我们还比较了DMSO对MCF-7细胞增殖作用的影响。如Fig 1B所示，加入不同浓度的DMSO后，MCF-7细胞生长状况基本良好，细胞指数曲线持续上升，DMSO未表现出明显的细胞毒性效应。

Fig 1　Real-time cell proliferation assays of

2.2TRAIL和SAHA联合作用对乳腺癌细胞增殖影响的实时测定为了探讨TRAIL对乳腺癌细胞增殖的影响，我们将不同浓度的TRAIL(0~100 μg·L-1)与乳腺癌MCF-7细胞共同培养于xCELLigence RTCA系统中。由于MCF-7是TRAIL非敏感性细胞系，低浓度TRAIL对其无明显的抑制作用，仅仅100 μg·L-1的高浓度TRAIL表现出一定程度的抑制效果(Fig 2A)。

当我们将0~100 μg·L-1TRAIL和5 μmol·L-1SAHA联合作用MCF-7细胞24 h时，其细胞指数急剧下降到基线底端(Fig 2B)，表示此时MCF-7细胞已基本死亡；而单独5 μmol·L-1SAHA处理24h的MCF-7细胞指数曲线才开始下降(Fig 1A)。因此，这一结果提示TRAIL的加入可能提高了SAHA对MCF-7细胞的药物敏感性。

我们通过MTT法进一步确认RTCA实时分析系统的检测结果(Fig 2C、2D)，结果显示100 μg·L-1TRAIL与5 μmol·L-1SAHA联合作用24 h可产生最佳的抑制MCF-7细胞生长效应，与对照组相比差异具有统计学意义。

2.3TRAIL和SAHA联合作用对乳腺癌细胞形态的影响为了收集SAHA、TRAIL等处理因素对MCF-7细胞增殖干扰作用的形态学证据，我们应用BioStationIM活细胞工作站观察SAHA、TRAIL对乳腺癌MCF-7细胞生长状况的影响。结果如Fig 3、4所示，随着时间的推移，DMSO对照组的细胞形态正常，生长状况良好，24 h时达到90%铺满率；而单独TRAIL、SAHA处理后的乳腺癌细胞呈现不同的形态学改变。单独SAHA处理后24 h出现形态学变化，细胞变长，细胞质呈放射状向外突出，细胞生长受到抑制，荧光显微镜下出现一些形态完整、大圆型的凋亡荧光细胞。而单独TRAIL处理对MCF-7细胞形态学影响不如SAHA效果明显，处理36 h才发生较明显的形态学改变，而荧光显微镜下呈现的是形态不完整、大小不一的小圆形荧光细胞。SAHA和TRAIL联合作用12 h后MCF-7就发生形态学变化，细胞核固缩，梭形细胞变多，48 h后细胞几乎全部死亡，荧光显微镜下呈现大量片状荧光染色的凋亡细胞。

3讨论

乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康，甚至危及生命的最常见恶性肿瘤之一。在乳腺细胞功能异常时，HDAC的活性明显增强，组蛋白处于低乙酰化状态，基因表达平衡状态被破坏，使一些调控细胞增殖、分化、凋亡的基因失活，导致乳腺癌的发生[13]。研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA具有良好的抑制肿瘤生长的作用[14]，可诱导MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SKBr-3等多种乳腺癌细胞凋亡的产生。但同时SAHA也具有毒副作用大、体内半衰期短、易代谢和易产生耐药等缺点[15]。因此，亟待我们寻找提高SAHA敏感性，降低其耐药性的新途径。

Fig 2　Real-time cell proliferation assays of treatment with TRAIL and SAHA for MCF-7 breast cancer cells

Fig 3　The microscopic observation of treatment with TRAIL and SAHA for MCF-7 breast cancer cells

TRAIL可特异性地抑制肿瘤细胞的生长，对正常细胞无明显毒副作用，具有良好的临床应用价值。因此我们在细胞水平上将SAHA与TRAIL联合作用于乳腺癌细胞，研究其协同作用对乳腺癌细胞增殖的影响，为将这两种药物更好地应用于临床提供支持。

本研究发现，单独SAHA对乳腺癌MCF-7细胞增殖有较强的抑制作用，并且这种抑制作用呈现时间和剂量依赖性。随着处理时间的延长、SAHA浓度的增加，乳腺癌细胞指数曲线下降，细胞生长被抑制。其中，浓度大于20 μmol·L-1的SAHA作用效果明显，孵育24 h就显现较明显的抑制效果，而浓度低于1.0 μmol·L-1的SAHA作用效果不明显，细胞指数曲线维持稳定，细胞生长状况未受太大影响。系统显示，当SAHA作用48 h时IC50达到最大值，此时所对应的浓度为5.0 μmol·L-1。

单独TRAIL处理对MCF-7细胞无明显的抑制作用，但将SAHA和TRAIL联合应用时发现，两种处理因素作用24 h即可使MCF-7细胞指数曲线急剧下降到基线底端，细胞几乎全部死亡，联合用药提高疗效达50%以上。活细胞工作站成像显示，联合用药12 h MCF-7细胞就发生形态学变化，细胞核固缩，梭形细胞变多，荧光显微镜下呈现大量片状荧光染色的凋亡细胞。这说明TRAIL的加入提高了SAHA对MCF-7细胞的敏感性。另外，由于在本实验中原本需要浓度20 μmol·L-1的SAHA作用24 h才能明显抑制MCF-7细胞的生长，而正是由于TRAIL的加入，在12 h的联合处理时间内，浓度为5 μmol·L-1的SAHA就可明显抑制MCF-7的生长，这也说明TRAIL的加入降低了SAHA的用药浓度，也就减少了SAHA的毒性作用。由于TRAIL本身具有对正常细胞低毒性的特点，SAHA和TRAIL对乳腺癌细胞生长的协同抑制作用也为临床上治疗乳腺癌提供了一个新的方案。

Fig 4　The fluorescent detection of treatment with TRAIL and SAHA for MCF-7 breast cancer cells

综上所述，SAHA联合TRAIL的使用改变了TRAIL单独使用效果不佳、对某些细胞不敏感的缺点，同时又避免了高浓度SAHA对乳腺癌细胞的毒副作用，两者联合应用可提高疗效，具有明显的协同杀伤乳腺癌细胞的作用，但是两者联合抑制MCF-7细胞增殖的分子机制还有待我们进一步研究。

(致谢：本实验内容在沈阳医学院辽宁省环境污染与微生态重点实验室完成，特此表示感谢！)

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Effects of combination treatment with SAHA and TRAIL on ER positive breast cancer cell MCF-7

HAN Han1, WANG Min2

(1.DeptofBiochemistry,2.DeptofPathogenicOrganism,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of combined treatment of SAHA and TRAIL on human breast cancer ER positive cell line MCF-7. MethodsMCF-7 cells were treated with SAHA and/or TRAIL. The inhibitory rates were detected by real-time cell proliferation assays. Morphology changes of MCF-7 cells were observed through time-lapse live cell imaging acquisition. ResultsReal-time cell proliferation assays showed that the anti-tumor efficacy of SAHA was significantly enhanced in combination with TRAIL. The results of time-lapse live cell imaging acquisition demonstrated that, with treatment of SAHA and TRAIL, the growth inhibition of MCF-7 cells was more obvious than that of in TRAIL or SAHA treatment alone. ConclusionThe combination treatment of SAHA and TRAIL has a synergistic effect of growth inhibition on breast cancer MCF-7 cells.

Key words:SAHA; TRAIL; breast cancer; ER positive; MCF-7 cell; synergistic effects

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)02-0223-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.015

作者简介:韩翰(1982-)，女，博士，讲师，研究方向：抗癌药物分析，Tel：024-62215669， E-mail：hanhan82831@163.com；王敏(1966- )，女，硕士，副教授，研究方向：肿瘤调控，通讯作者, Tel：024-62215670， E-mail：lilywangmin@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81172509)；沈阳医学院科技发展基金(No 20135061)

收稿日期：2015-10-26，修回日期：2015-11-16

网络出版时间：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.030.html网络出版地址：2016-1-25 15:57